Nested PCR و طراحی پرایمر برای آن

زمان تخمینی مطالعه: 11 دقیقه

اساس Nested PCR و طراحی پرایمر‌های آن

تکنیک Nested PCR یا پی سی آر تودرتو، فرمی از PCR استاندارد است که به‌جای یک دور، به دو دور متوالی از تکثیر نیاز دارد؛ به این معنا که در این روش از دو مجموعه پرایمر (یک جفت پرایمر درونی و یک جفت پرایمر بیرونی) و دو واکنش متوالی PCR برای تکثیر یک توالی هدف استفاده می‌شود. محصول اولین واکنش تکثیر، به‌عنوان الگویی برای دور دوم Nested PCR استفاده می‌شود.

در تصویر زیر، می‌خواهیم اصول این تکنیک را به شما نمایش دهیم. قصد انجام این تست، تکثیر ”ناحیه هدف“ (توالی بنفش) می‌باشد.

در دور اول PCR، از یک جفت پرایمر بیرونی برای تکثیر ناحیه‌ای وسیع‌تر از توالی هدف (توالی آبی دربردارنده توالی بنفش) استفاده می‌کنیم. در دور دوم PCR، محصول دور قبل را به‌همراه پرایمرهای درونی که برای ناحیه هدف ما اختصاصی هستند، به‌کار‌می‌بریم. محصول دور دوم PCR، همان هدف نهایی مطالعه ما است که پس از تکثیر می‌توانیم بر‌اساس طول توالی قطعه، با ژل الکتروفورز آن را مشاهده کنیم.

هدف PCR تو‌در‌تو افزایش اختصاصیت و حساسیت در تکثیر توالی DNA موردنظر است.

اختصاصیت بهبود‌یافته واکنش، به‌خاطر اتصال دو مجموعه جداگانه پرایمر به یک الگوی هدف رخ می‌دهد. باید بگوییم که حتی اگر محصولات غیراختصاصی در دور اول PCR و توسط پرایمرهای بیرونی تکثیر شوند، بعید است که همان محصولات در دور دوم PCR توسط پرایمرهای درونی هم شناسایی شوند. بر این اساس، اختصاصیت Nested PCR این‌گونه توسط پرایمرها ارتقا می‌یابد.

حساسیت بهبود‌یافته واکنش هم به‌دلیل وقوع دو واکنش متوالی است که در Nested PCR رخ می‌دهند. وقتی تعداد چرخه‌های تکثیری بیشتری داشته‌باشیم، میزان DNA اولیه زیاد شده و در نتیجه حساسیت PCR افزایش می‌یابد.

کاربردهای تکنیک Nested PCR

در PCR استاندارد، از یک جفت پرایمر برای تکثیر توالی هدف استفاده می‌شود. با این حال، در موارد خاص، مانند ۱) زمانی که مقدار DNA هدف کم است، یا ۲) زمانی که چالش‌های تکثیر غیر‌اختصاصی برای ناحیه موردنظر وجود دارد، PCR استاندارد ممکن است نتایج رضایت‌بخشی را به‌همراه نداشته‌باشد. اینجاست که PCR تو‌در‌تو وارد عمل می‌شود.

مقدار کم DNA هدف

گاهی نیاز است که یک رونوشت ژنی خاص (mRNA) را از کل محتوای mRNA یک نمونه بالینی که حاوی جمعیت ناهمگنی از انواع سلول‌ها است، تکثیر کنیم؛ یا ممکن است بخواهیم پاتوژن‌هایی مثل باکتری، ویروس، قارچ یا انگل را که به مقادیر خیلی کم در نمونه وجود دارند، شناسایی کنیم. در این دو صورت، تکنیک Nested PCR به محققین کمک می‌کند.

فرض کنید که در مطالعه خود با میکروارگانیسم‌های سخت‌گیر (Fastidious) سروکار دارید. این میکروارگانیسم‌ها نیازهای غذایی یا شرایط رشد پیچیده‌ای دارند و جداسازی یا کشت آن‌ها در آزمایشگاه دشوار است. برخی از نمونه‌های میکروارگانیسم‌های سخت‌گیر عبارتند از کلامیدیا، مایکوباکتریوم، لژیونلا، بارتونلا، و ریکتزیا. این تکنیک می‌تواند با افزایش حساسیت و اختصاصیت واکنش، به شناسایی این میکروارگانیسم‌ها کمک کند.

پیشنهاد: دوره جامع طراحی پرایمر یک فرصت طلایی برای یادگیری حرفه‌ای طراحی پرایمر در تکنیک Nested PCR با استفاده از ابزار‌های پرکاربرد در این حوزه است.

ثبت‌نام در دوره جامع طراحی پرایمر

مثلاً کشت و تشخیص Chlamydia abortus و Chlamydia psittaci (باکتری‌های داخل سلولی که باعث سقط جنین و بیماری‌های تنفسی در حیوان و انسان می‌شوند) با روش‌های مرسوم دشوار است. برای تکثیر توالی ژن 16S rRNA آنها از نمونه‌های بالینی، به PCR تو‌در‌تو نیاز است.

مثال دیگر، استفاده از  Nested PCR برای تشخیص مایکوباکتریوم توبرکلوزیس (عامل ایجادکننده سل) می‌باشد. این باکتری به کندی رشد می‌کند و به محیط‌های کشت خاص و اقدامات احتیاطی ایمنی زیستی نیاز دارد.  Nested PCR می‌تواند توالیِ درجی IS6110 را از نمونه‌های خلط تکثیر کند، و به‌این صورت برای تشخیص و مطالعات اپیدمیولوژیک استفاده شود.

*** IS6110 یک عنصر ژنتیکی متحرک است که به‌ طور انحصاری در کمپلکس مایکوباکتریوم توبرکلوزیس (MTBC) وجود دارد. این توالی کدکننده آنزیم transposase می‌باشد، آنزیمی که حرکت این عنصر را در ژنوم باکتریایی میانجی‌گری می‌کند.

چالش‌های تکثیر غیر‌اختصاصی

از جمله چالش‌های پیش‌ روی زیست‌شناسان، تکثیر یکی از ژن‌های مربوط به خانواده ژنی چندشکلی (پلی‌مورفیک) است.

اما خانواده ژنی چندشکلی چیست؟ گروهی از ژن‌ها که تشابه بالایی در توالی دارند اما بیان یا عملکردهای متفاوتی از خود نشان می‌دهند، یک خانواده ژنی چندشکلی را تشکیل می‌دهند.

مثال: مجموعه ژن‌های HLA که آنتی‌ژن‌های لکوسیت انسانی را کد می‌کنند، و در شناسایی و پاسخ ایمنی نقش دارند.

تکثیر یک عضو خاص از یک خانواده ژنی چندشکلی می‌تواند چالش‌برانگیز باشد، زیرا PCR معمولی ممکن است محصولات غیر‌اختصاصی را از سایر اعضای خانواده ژن یا سایر مناطق ژنوم تولید کند.

Nested PCR می‌تواند با استفاده از دو مجموعه پرایمر بر این مشکل غلبه کند. اولین مجموعه پرایمرها برای اتصال به توالی‌هایی طراحی می‌شوند که در بین اعضای خانواده ژنی حفاظت شده‌اند (توالی مشترک)، در حالی که مجموعه دوم پرایمرها برای اتصال به توالی‌هایی طراحی شده‌اند که منحصر به ژن هدف هستند.

با استفاده از مجموعه اول پرایمرها، می‌توانید ناحیه وسیع‌تری را که حاوی ژن هدف و سایر اعضای خانواده ژنی است، تکثیر کنید. این مجموعه از پرایمرها به‌طور مؤثرتری به الگوی DNA متصل می‌شوند، زیرا توالی‌های حفظ‌شده فراوان‌تر و در دسترس‌تر هستند. سپس، باید از مجموعه دوم پرایمرها برای تکثیر ناحیه هدف که در توالی محصول PCR دور اول جای دارد، استفاده‌کنید. مجموعه دوم پرایمرها می‌توانند راحت‌تر به محصول دور اول متصل شوند، زیرا غلظت بالاتر دارد و پیچیدگی کمتری نسبت به DNA قبل از PCR دارد.

اگر مسیر تست را به‌درستی پیش بروید، در دور دوم PCR محصولی را دارید که همان ژن هدف شما است.

مزایا و معایب

در این بخش تعدادی از مزیت‌ها و معایب استفاده از تکنیک PCR تو‌در‌تو را بررسی می‌کنیم:

مزایای Nested PCR:

• می‌تواند مقادیر بسیار کمی از DNA را حتی از یک سلول تکثیر کند چرا که با وجود دو دور PCR، بازده محصول موردنظر افزایش می‌یابد.
• می‌تواند تکثیر محصولات غیر‌اختصاصی را کاهش دهد زیرا دور دوم PCR به‌احتمال‌زیاد هرگونه خطای ناخواسته در تکثیر محصولات اشتباهی دور اول را حذف می‌کند.
• می‌تواند با هدف‌گیری نواحی ژنی حفاظت‌شده یا متنوع، در آنالیز فیلوژنتیکی و یا چندشکلی ژنتیکی (پلی‌مورفیسم) کمک کند.
• می‌تواند با تکنیک‌های دیگر مانند Real-time PCR و Multiplex PCR ادغام شود تا قابلیت‌های جدیدی را کسب کند. مثلاً Multiplex Nested PCR، از چند مجموعه پرایمر برای هر دور PCR استفاده می‌کند که امکان تشخیص همزمان چندین هدف را در یک نمونه واحد فراهم می‌سازد. Real-time nested PCR هم با استفاده از پروب یا رنگ فلورسنت، امکان تعیین کمّی توالی هدف را فراهم می‌آورد.

معایب Nested PCR:

• خطر آلودگی بالایی دارد، زیرا محصولات دور اول PCR باید برای دور دوم به یک لوله جدید منتقل شوند.
• هزینه‌بر است، زیرا نسبت به PCR استاندارد به اجزای بیشتری مانند پرایمر و نوکلئوتیدهای اضافی برای واکنش نیاز دارد.
• می‌تواند مستعد مثبت کاذب باشد، زیرا محصولات دور اول PCR می‌توانند به‌عنوان الگو برای دور دوم هم عمل کنند که منجر به تکثیر غیر‌اختصاصی می‌شود. (این موضوع متناقض با اختصاصیتِ افزایش‌یافته در این تکنیک است، ولی این احتمال هم وجود دارد که در صورت رعایت نکردن اصول طراحی این تست، با چنین عدم اختصاصیتی هم برخورد کنید)
• بهینه سازی PCR تو‌در‌تو ممکن است دشوار باشد، زیرا به طراحی دقیق پرایمرها برای هر دو دور PCR نیاز دارد.
• کمی وقت‌گیر است، چراکه به دو نوبت PCR نیاز دارد.

پیشنهاد: افزایش فرصت‌های شغلی و تحقیقاتی با شرکت در دوره بیوانفورماتیک عمومی و کسب مهارت‌های اساسی بیوانفورماتیک.

ثبت‌نام در دوره بیوانفورماتیک عمومی

انواع Nested PCR

PCR تو‌در‌تو بسته به نحوه انجام ۲ دور واکنش، حالت‌های مختلفی دارد که بایستی باتوجه به هدف مطالعه و منابع موجود، نوع تکنیک موردنظر خود را انتخاب کنید.

PCR نیمه‌-تودرتو (Semi-nested PCR)

در این روش، یکی از پرایمرهای درونی کاملاً مشابه یکی از پرایمرهای بیرونی است و پرایمر درونی دیگر، توالی متفاوتی با پرایمرهای بیرونی دارد. پس این تکنیک درمجموع به ۳ نوع پرایمر نیاز دارد. استفاده از Semi-nested PCR منجر به تولید محصول کوتاه‌تری نسبت‌به دور اول PCR می‌شود، اما نه به کوتاهی محصولی که با دو پرایمر داخلی مختلف تکثیر می‌شود!

Hemi-nested PCR

در این روش، از دو نوع پرایمر استفاده می‌کنیم: پرایمرهای بیرونی و پرایمر Hemi-nested.

پرایمرهای بیرونی در دور اول PCR برای تکثیر قطعه بزرگی از ژن هدف استفاده می‌شوند (درست مانند Nested PCR معمولی و Semi-nested PCR).

در دور دوم، پرایمر Hemi-nested که کاملاً مشابه یکی از پرایمرهای بیرونی است، به همان ناحیه‌ای از ژن هدف که پرایمر بیرونی به آن وصل شده بود، متصل می‌شود.

دور دوم PCR، از همین یک پرایمر برای یک رشته از DNA استفاده می‌کند و رشته دیگر در دور دوم تکثیر نمی‌شود. این موضوع منجر به تکثیر خطی به‌جای تکثیر نمایی می‌شود (در زمانی که یک جفت پرایمر در واکنش حضور دارند، محصول در سیکل PCR دو برابر می‌شود که به آن تکثیر نمایی می‌گویند)، که می‌تواند تشکیل پرایمر-دایمر و محصولات غیر‌اختصاصی را کاهش دهد.

PCR تودرتو تک‌لوله‌ای (Single-tube nested PCR)

در روش کلاسیک PCR تو‌در‌تو، بعد از اینکه تعدادی چرخه پی سی آر با استفاده از اولین مجموعه پرایمرها انجام‌ می‌شود، بایستی درِ لوله واکنش را باز کرد و مجموعه پرایمرهای دوم را برای اجرای PCR بعدی اضافه‌کرد. مشکل اصلی این روش آلوده‌شدن محتویات واکنش در آزمایشگاه و در نتیجه از دست رفتن اختصاصیت تست است.

برای رفع این چالش، Single-tube nested PCR ابداع شده که هر دو دور PCR را در یک لوله واکنش انجام می‌دهد. این تکنیک نسبت به‌روش کلاسیک، ساده‌تر است و خطر آلودگی و مثبت کاذب را کاهش می‌دهد.

نتیجه‌گیری

در این مقاله سعی کردیم شما را با تکنیک Nested PCR و اصول طراحی پرایمر برای آن آشنا کنیم. به‌علاوه، مزایا و معایب این تکنیک، کاربرد‌های متنوع آن و انواع مختلف Nested PCR را نیز شرح دادیم.

آیا تجربه استفاده از این تکنیک رو داری؟ از چالش‌های این تست در بخش دیدگاه‌ها برای ما بگو …

منابع

Green MR, Sambrook J. Nested polymerase chain reaction (PCR). Cold Spring Harbor Protocols. 2019 Feb 1;2019(2)

Thermo Fisher Scientific Inc

سوالات متداول