طراحی پرایمر چیست؟ طراحی پرایمر به زبان ساده و کاربردی برای PCR

زمان تخمینی مطالعه: 17 دقیقه

پرایمر و هدفِ طراحی پرایمر

برای ورود به بحث طراحی پرایمر، ابتدا باید با خودِ پرایمر آشنا شویم.

پرایمر (primer) یک اسید نوکلئیک تک‌رشته‌ای کوتاه است که همه موجودات زنده برای شروع سنتز DNA از آن استفاده می‌کنند. پرایمر نقطه شروعی را برای فعالیت DNA پلیمراز فراهم می‌کند.

DNA پلیمراز آنزیمی است که رشته‌های جدید DNA را در مقابل رشته قدیمی (به‌عنوان الگو) سنتز می‌کند.

در واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR)، تکنیکی که از آن برای ساختن کپی‌های زیادی از یک ناحیه خاص از DNA استفاده می‌کنیم، پرایمرها طوری توسط محقق طراحی می‌شوند که مکمل دو انتهای ناحیه هدف بوده و به آن‌ها متصل شوند. با انجام این کار، پرایمرها مرزهای ناحیه‌ای را که می‌خواهیم تکثیر کنیم، مشخص می‌کنند.

بر این اساس، جفت‌پرایمری که در PCR استفاده می‌کنیم این‌گونه نام‌گذاری می‌شوند: پرایمر فوروارد یا روبه‌جلو (Forward) و پرایمر ریورس یا معکوس (Reverse)

هدف از طراحی پرایمرها، اطمینان از اتصال اختصاصی و پایدار آن‌ها به DNA الگو است که منجر به اجرای یک PCR موفق و تکثیر ناحیه ژنومی موردنظر می‌شود.

کاربرد‌ها

در اینجا به‌طور خلاصه برخی از کاربردهای طراحی پرایمر را بررسی می‌کنیم:

طراحی پرایمر برای تعیین توالی ژنوم یا ژنوتایپینگ

طراحی پرایمر برای تولید پرایمرهایی استفاده می‌شود که برای تکنیک‌های توالی‌یابی ژنوم مانند NGS یا Sanger به کار می‌روند. همچنین برای تعیین پلی‌مورفیسم‌های تک نوکلئوتیدی (SNP)، که تغییراتی در یک جفت باز واحد از DNA هستند، طراحی پرایمر نیاز است.

طراحی پرایمر برای کلون‌سازی ژن (Gene Cloning)

طراحی پرایمر برای تولید پرایمرهایی استفاده می‌شود که می‌توانند ژن مورد نظر ما را در یک وکتور (مانند پلاسمید یا ویروس) برای تکثیر یا بیان در یک سلول میزبان وارد کنند. پرایمرها معمولاً دارای محل‌های آنزیم محدودکننده در انتهای خود هستند که می‌توانند وکتور و ژن را برش دهند و به آنها اجازه دهند تا با بستن (Ligation) به یکدیگر متصل شوند.

طراحی پرایمر در تکنیک CRISPR-Cas9

طراحی پرایمر را برای ساخت پرایمرهایی استفاده می‌کنیم که می‌توانند جهش‌ها یا تغییرات هدفمند را در ژنوم با استفاده از سیستم CRISPR-Cas9 ایجاد کنند. پرایمرها را می‌توان برای تولید RNA‌ راهنما (gRNA) استفاده کرد که می‌تواند آنزیم Cas9 را به یک مکان خاص در DNA هدایت کند و یک شکست دو‌رشته‌ای در DNA ایجاد کند. پرایمرها همچنین می‌توانند برای تولید الگوهای تعمیری (Repair templates) استفاده شوند که می‌توانند تغییرات مورد نظر را در DNA در طول فرآیند تعمیر ایجاد کنند.

طراحی پرایمر در انگشت نگاری دی ان ای (DNA fingerprinting)

طراحی پرایمر برای تولید پرایمرهایی استفاده می‌شود که می‌توانند تکرارهای پشت‌سرهم کوتاه (STRs) را تکثیر کنند. STR‌ها بسیار چندشکلی (polymorphic) هستند و می‌توانند برای تشخیص افراد بر اساس پروفایل DNA آنها استفاده شوند. از این روش برای آزمایش‌های پزشکی قانونی، تعیین ابوت (پدری) یا تبارشناسی ژنتیکی (genetic genealogy) استفاده میکنیم.

طراحی پرایمر در بارکدینگ دی ان ای (DNA barcoding)

طراحی پرایمر برای تولید پرایمرهایی استفاده می‌شود که می‌توانند ناحیه خاصی از DNA را تکثیر کنند تا به‌عنوان بارکد برای شناسایی گونه‌ها استفاده شود. بارکدینگ DNA روشی است که می‌تواند به کشف گونه‌های جدید، نظارت بر تنوع زیستی یا ردیابی محصولات غذایی کمک کند.

پارامتر‌های طراحی پرایمرهای ایده‌آل

برای تکثیر اختصاصی ناحیه ژنومی موردنظر (سایز ایده‌آل محصول: ۱۰۰ تا ۱۰۰۰ باز طول)، باید پرایمرهای خود را با دقت بالایی طراحی کنید. به این منظور یک‌سری پارامترها برای طراحی پرایمر مطرح شده‌اند که برای هر پارامتر یک محدوده ایده‌آل وجود دارد. بهتر است تا حد امکان، پرایمرهایی طراحی کنید که ویژگی‌های آن‌ها با این محدوده هم‌خوانی دارد.

در این قسمت شما را با پارامترهای اساسی طراحی پرایمر و معیارها یا محدوده‌های ایده‌آل آن‌ها آشنا می‌کنیم:

طول پرایمر

طول مناسب برای پرایمرها بین ۱۸ تا ۲۳ باز است. پرایمرهای کوتاه‌تر ممکن است منجر به تکثیر غیراختصاصی شوند و پرایمرهای طویل‌تر می‌توانند باعث کاهش کارایی فاز extension یا پلیمریزاسیون DNA در PCR شوند.

محتوای GC و دمای ذوب در طراحی پرایمر

مجموع درصد بازهای G و C پرایمر باید بین 40 تا 60 باشد. درصد GC به‌طور مستقیم با دمای ذوب پرایمر ارتباط دارد. اما این دمای ذوب به چه معناست؟

دمای ذوب پرایمر (Melting Temperature) یا Tm دمایی است که در آن نیمی از مولکول‌های پرایمر به‌صورت تک‌رشته هستند و نیم دیگر به‌صورت دورشته (متصل به DNA الگو)

فرمول محاسبه Tm پرایمر به صورت زیر است:

Tm = [4(G + C) + 2(A + T)] °C

محتوای GC بالا در پرایمر، به‌دلیل وجود ۳ پیوند هیدروژنی بین G و C (در برابر ۲ پیوند بین بازهای A و T)، برهمکنش پرایمر—DNA هدف را پایدار می‌کند و Tm پرایمر را افزایش می‌دهد. محتوای GC پایین‌تر از ۴۰، برهمکنش پرایمر— DNAهدف را ناپایدار می‌کند و اختصاصیت PCR را کاهش می‌دهد.

محدوده ایده‌آل برای Tm پرایمر بین ۵۰ تا ۶۰ درجه در نظر گرفته‌می‌شود.

توجه کنید که دمای Tm برای هر پرایمر جداگانه محاسبه می‌شود و بهتر است که اختلاف Tm بین جفت‌پرایمر شما کمتر از ۵ درجه باشد.

دمای بهینه Annealing یا Ta به‌صورت تجربی به‌دست‌می‌آید، اما به‌طورکلی حدود ۲ تا ۵ درجه از Tm پایین‌تر است. دمای اتصال پرایمر دمایی است که بر اساس Tm پرایمرها محاسبه می‌شود و درواقع آن را برای فاز Annealing یا اتصال در PCR بر روی ترموسایکلر تنظیم می‌کنیم.

یکی از راه‌های رایج برای یافتن Ta، انجام PCR با یک گرادیان دمایی است که با حدود ۵ درجه کمتر از پایین‌ترین Tm جفت پرایمر آن را شروع می‌کنیم.

ساختار‌های ثانویه در طراحی پرایمر

ساختار‌های ثانویه (Secondary structures) ساختارهایی هستند که وقتی پرایمر روی خود تا بخورد یا با پرایمر دیگری پیوند هیدروژنی تشکیل دهد، به وجود می‌آیند. این ساختار‌ها عبارتند از:

ساختارهای سنجاق‌سری (hairpin): وقتی پرایمر به‌دلیل وجود بازهای مکمل، روی خود تا بخورد.

پرایمر دایمر (Primer-Dimer): دو پرایمر که دارای توالی‌های مکمل هستند و بین آن‌ها پیوند بین‌مولکولی برقرار می‌شود.

در تصویر زیر، به‌ترتیب از سمت چپ، ساختار سنجاق‌سری، ساختار پرایمر-دایمر هم‌جنس (Self-Dimer) برای پرایمرهای forward و پرایمر-دایمر غیرهم‌جنس (Cross-Dimer) برای پرایمرهای forward و Reverse را مشاهده می‌کنید:

در ارتباط با ساختارهای ثانویه پرایمرها، دو فاکتور را باید بررسی کنیم:

• تعداد پیوندهای هیدروژنی که ساختارهای ثانویه را ایجاد می‌کنند، چندتا هستند؟

در انتهای ‘3 پرایمرها تا ۳ پیوند هیدروژنی قابل قبول است و در سایر نواحی پرایمر تا ۴ پیوند هیدروژنی.

• مقدار ΔG برای تشکیل چنین ساختارهایی چقدر است؟

تغییرات انرژی آزاد گیبس یا ΔG به ما می‌گوید که آیا یک واکنش یا فرایند خودبه‌خودی است یا خیر.

یک واکنش خودبه‌خودی، می‌تواند بدون ورودی انرژی خارجی اتفاق بیفتد. ΔG برای چنین واکنشی منفی است و انرژی آزاد می‌شود. یک واکنش غیرخودبه‌خودی، برای وقوع به انرژی خارجی نیاز دارد. ΔGبرای چنین فرایندی مثبت است و انرژی جذب می‌شود.

ΔG منفی‌تر به معنی تعامل پایدارتر و مطلوب‌تر است، در حالی که ΔG مثبت‌تر به معنی تعامل با پایداری کمتر و نامطلوب است.

بهتر است ΔG تشکیل ساختارهای ثانویه پرایمرها برای hairpin از ۲- و برای دایمرها هم از ۵- مثبت‌تر باشد.

*** به‌طور کلی، ساختارهایی که سر ‘3 پرایمر را بیشتر درگیر کرده‌اند، مضرترند چراکه پلیمریزاسیون نوکلئوتیدها در PCR برای ساخت رشته جدید، در سر ‘3 پرایمر است که اتفاق می‌افتد.

پایداری انتهای ‘3 پرایمر

پایداری انتهای ‘3 پرایمر، بر توانایی آن برای اتصال به DNA الگو در طی PCR تأثیر می‌گذارد (افزایش اختصاصیت و کارایی PCR)

یک انتهای پایدار (یک GΔ منفی‌تر) به کاهش اتصالات غیراختصاصی کمک می‌کند. معمولا عدد بهینه برای این پارامتر را ۹- تا ۱۲- عنوان می‌کنند.

به وجود بازهای G یا C در 5 باز انتهای ‘3 پرایمر، گیره GC می‌گوییم. تعداد بهینه برای گیرهGC، ۲ باز G یا C در انتهای پرایمر است.

تکرار‌ها و ران‌ها

تکرارهای پشت‌سرهم دی‌نوکلئوتیدی را تکرار و تکرارهای پشت‌سرهم تک‌نوکلئوتیدی را ران می‌نامیم. حداکثر تعداد تکرارهای دی‌نوکلئوتیدی و تک‌نوکلئوتیدی قابل قبول در پرایمر، ۴ تا است.

در غیراینصورت، پرایمر حاوی تکرار ممکن است به‌اشتباه به‌جای دیگری وصل شود.

بررسی پلی‌مورفیسم‌ها در طراحی پرایمر

برای داشتن پرایمینگ موفق (اتصال موفقیت‌آمیز پرایمر به DNA هدف) و PCR دقیق، بایستی مراقب SNP‌ها باشید.

باید ناحیه‌ای از ژنوم که پرایمر به آن متصل می‌شود را از نظر وجود پلی‌مورفیسم‌ها چک کنید. خصوصا ۵ باز انتهای ‘3 پرایمر‌ها نباید SNP‌های رایجی با فراوانی جمعیتی بیشتر از ۵ درصد داشته باشند.

در دیتابیسی مانند dbSNP از NCBI می‌توانید فراوانی جمعیتی نواحی پلی‌مورف را بررسی کنید.

معرفی ابزار‌های طراحی پرایمر

به‌طور کلی برای طراحی پرایمر ابزارهای آنلاین و آفلاین متعددی توسعه پیدا کرده‌اند. شما می‌توانید از نرم‌افزار بخواهید که براساس معیارهای موردنظرتان پرایمرهای ایده‌آلی طراحی کند.

تعدادی از این نرم‌افزارها عبارتند از:

Oligo 7

الیگو ۷ یک نرم‌افزار طراحی الیگونوکلئوتیدی جامع است که در طراحی پرایمر و پروب برای کاربردهای PCR، آنالیز بیان ژن و توالی‌یابی به کار می‌آید. Oligo 7 با ارائه محاسبات ترمودینامیکی پیشرفته و تجزیه و تحلیل اختصاصیت، محققان را قادر می‌سازد تا پرایمرهایی با دقت و کارایی بالا طراحی کنند.

برای آشنایی بیشتر، می‌توانید مقاله Oligo 7: طراحی پرایمر با نرم‌افزار الیگو ۷، دانلود و آموزش گام‌به‌گام را بخوانید 🤩

GeneRunner

GeneRunner یک ابزار بیوانفورماتیکی همه‌کاره است که برای زیست‌شناسان مولکولی طراحی شده و یک رابط کاربرپسند برای کارهایی مانند آنالیز توالی، حاشیه‌نویسی (annotation)، و طراحی پرایمر ارائه می‌دهد. ویژگی‌های آن شامل بررسی اختصاصیت پرایمر و ابزارهای بصری‌سازی (visualization) برای تجربه لذت طراحی پرایمر است.

FastPCR

نرم‌افزار FastPCR یک ابزار طراحی پرایمر و in silico PCR جامع است که طیف وسیعی از ابزارها را برای بهینه سازی PCR و ارزیابی پرایمر ارائه می‌دهد. این ابزار که به دلیل سرعت و دقت خود شناخته شده است، طراحی پرایمرها را برای PCR استاندارد و long-range PCR تسهیل می‌کند و به محققان در طراحی آزمایش کمک می‌کند.

AlleleID

AlleleID یک مجموعه نرم‌افزاری است که نیازهای متنوع زیست‌شناسان مولکولی را برآورده می‌کند و ابزارهای پیشرفته‌ای را برای طراحی پرایمر و پروب ارائه می‌دهد. قابلیت‌های آن شامل تشخیص الل، تجزیه و تحلیل ساختار ثانویه، و ارزیابی اختصاصیت الیگونوکلئوتیدها است.

OligoAnalyzer (IDT)

الیگوآنالایزر، ارائه‌شده توسط شرکت Integrated DNA Technologies (IDT)، یک ابزار مبتنی بر وب است که خواص الیگونوکلئوتیدها را تجزیه و تحلیل و بهینه می‌کند. OligoAnalyzer با ویژگی‌هایی مانند محاسبه دمای ذوب (Tm) و پیش‌بینی ساختار ثانویه، به محققان در طراحی پرایمرها و پروب‌هایی با ویژگی‌های هیبریداسیون دقیق کمک می‌کند.

Primer3

Primer 3 یک نرم‌افزار طراحی پرایمر پرکاربرد است که به‌طور خودکار طراحی پرایمرهای PCR را انجام می‌دهد. Primer3 با تمرکز بر اختصاصیت و کارآمدی پرایمر با بهینه سازی in silico PCR، ابزاری ارزشمند برای محققانی است که هدفشان دستیابی به نتایج دقیق و قابل‌اعتماد PCR می‌باشد.

Primer BLAST

بعد از طراحی پرایمرهایی که ویژگی‌های ایده‌آل دارند، باید چک کنیم که آیا برای ناحیه هدف ما بر روی ژنوم هم اختصاصی هستند یا خیر؟ به‌این معنا که فقط همان ناحیه هدف را شناسایی و تکثیر می‌کنند یا به نواحی نامطلوب که هدف مطالعه ما نیستند (Unintended targets) هم می‌توانند متصل شوند؟

پرایمر بلاست از دو نرم‌افزار BLAST و Primer3 برای طراحی پرایمر استفاده می‌کند. ابزار پرایمر بلاست (Primer BLAST) علاوه بر اینکه می‌تواند بر اساس معیارهای موردنظر شما طراحی پرایمر کند، می‌تواند اختصاصیت پرایمرهای طراحی‌شده با ابزارهایی که نام بردیم را هم بررسی کند.

چرا باید اختصاصیت پرایمر‌ها را چک کنید؟ تا مطمئن شوید که پرایمرهای شما ناحیه غیرهدف را تکثیر نمی‌کنند.

اگر پرایمرهایی که با نرم‌افزار طراحی کردید، اختصاصی نبودند، تا جای ممکن آن‌ها را جابه‌جا کنید تا مطمئن شوید می‌توانید پرایمرهای اختصاصی طراحی کنید.

توجه کنید که گاهی مجبوریم پرایمرها را با سخت‌گیری کمتری در پارامترهای موردنظر طراحی کنیم تا بتوانیم ناحیه هدف را تکثیر کنیم. در این‌صورت با تنظیم شرایط دمایی PCR یا اضافه کردن ترکیبات خاصی به تیوب واکنش، به تکثیر با پرایمرهای غیرایده‌آل خود کمک می‌کنیم.

برای آشنایی بیشتر، می‌توانید مقاله طراحی پرایمر در سایت NCBI با ابزار Primer BLAST را بخوانید 🤩

طراحی پرایمر برای اهداف مختلف

اغلب اوقات نیاز داریم تست PCR معمولی را با توجه به اهداف مطالعه خود تغییر دهیم. در این صورت لازم است استراتژی طراحی پرایمر را تغییر دهیم که در نتیجه اسم روش PCR هم تغییر می‌کند.

مواردی از این دست را برای شما معرفی می‌کنیم:

Multiplex PCR

این روش با هدف تکثیر همزمان چند ناحیه هدف در DNA الگو طراحی می‌شود. پی سی آر چندتایی در یک لوله واکنش و با استفاده از چند جفت پرایمر انجام می‌گیرد، به همین دلیل برای تکثیرِ موفق و همزمان محصولات، به سازگاری جفت پرایمرها وابسته است.

برای مطالعه بیشتر، می‌توانید وارد صفحه تکنیک Multiplex PCR شوید 😊

Nested PCR

این روش به‌منظور افزایش اختصاصیت و حساسیت تست PCR ابداع شده و می‌تواند به شناسایی و تکثیر DNA هدف در شرایط تحقیقاتی پیچیده کمک کند. تکنیک Nested PCR از دو مجموعه پرایمر (یک ست بیرونی و یک ست درونی) و دو PCR متوالی برای تکثیر یک توالی هدف استفاده می‌کند.

می‌توانید مقاله Nested PCR در گروه بیوانفورماتیک وانیار را مطالعه کنید ✨

ARMS-PCR

این تکنیک بر اساس استفاده از پرایمرهای اختصاصی برای هر الل طراحی شده است. آرمز پی سی آر می‌تواند برای تشخیص SNP‌ها و حذف یا اضافه‌شدگی‌های کوچک در سطح ژنوم استفاده شود.

برای آشنایی کامل‌تر با این تکنیک، به مقاله ARMS-PCR مراجعه کنید 😎

PCR-RFLP

این تکنیک با اثردهی آنزیم‌های محدودکننده بر محصول PCR و ایجاد الگوهای خاص برشی، به تشخیص SNP‌ها و حذف یا اضافه‌شدگی‌های کوچک در سطح ژنوم کمک می‌کند. در این روش، علاوه بر طراحی پرایمر‌های مناسب، بایستی آنزیم محدود‌کننده مناسبی برای ژنوتایپینگ انتخاب کنید.

اگر علاقه‌مندید با جزئیات این تکنیک آشنا شوید، می‌توانید مقاله PCR-RFLP را درباره این روش و کاربرد آنزیم‌های محدود‌کننده مطالعه کنید … 😃

RT-PCR

RT-PCR تکنیکی است که برای سنجش مقدار یک RNA خاص در یک نمونه مانند بیان یک ژن یا بار ویروسی به کار می‌آید. این روش از رونویسی معکوس برای تبدیل RNA به cDNA استفاده می‌کند. سپس با طراحی پرایمرهای مناسب برای تکثیر توالی cDNA (متفاوت با DNA)، PCR صورت می‌گیرد.

Q-PCR

PCR کمی (qPCR) برای تکثیر و آنالیز کمّی DNA، با سنجش فلورسانس منتشر‌شده در طول فرایند تکثیر استفاده می‌شود. در Q-PCR بایستی پرایمرها یا پروب‌های خاصی برای هدف قرار دادن و تکثیر ناحیه مورد‌نظر در نمونه DNA استفاده کنید تا امکان تعیین کمیت دقیق توالی هدف، مانند تنوع تعداد کپی (CNV) را فراهم کند.

PCR برای بررسی وضعیت متیلاسیون DNA

محققین برای بررسی الگوی متیلاسیون DNA، عمدتا DNA را بی‌سولفیته می‌کنند تا بین سیتوزین‌های متیله و غیر‌متیله تمایز قائل شوند. استفاده از پرایمر‌های خاص برای DNA بی‌سولفیته، امکان ارزیابی الگوی متیلاسیون را در نواحی مانند پروموتر ژن ایجاد می‌کند.

در مقاله طراحی پرایمر برای بررسی الگوی متیلاسیون DNA، می‌توانید بیشتر یاد بگیرید … 🍏

نتیجه‌گیری

در این مقاله از مجله گروه بیوانفورماتیک وانیار، سعی کردیم به جنبه‌های اساسی طراحی پرایمر بپردازیم.

در ابتدای نوشته به توضیح پرایمر و هدف از طراحی پرایمر اشاره کردیم. سپس شما را با کاربرد‌های طراحی پرایمر آشنا کردیم. در ادامه به معرفی معیار‌های طراحی پرایمر‌های ایده‌آل پرداختیم و پس از آن تعدادی از ابزار‌های کاربردی در طراحی پرایمر را به شما معرفی کردیم. در انتهای مقاله نیز برای آشنایی شما با طراحی پرایمر برای هدف‌های تحقیقاتی گوناگون یا PCR‌های متنوع مطالبی گفتیم که امیدواریم برایتان مفید بوده باشند.

آیا نکات دیگری برای طراحی پرایمر‌های ایده‌آل می‌توانید اضافه کنید؟

سوالات متداول