توالی یابی RNA با فناوری توالی یابی نسل جدید NGS

توالی یابی RNA با فناوری NGS

توالی یابی RNA (RNA-Seq) تحول بزرگی در مطالعه انواع مولکول های RNA (transcriptome) در سلولها ایجاد کرده است. این نوع توالی یابی، ابزاری بسیار حساس و دقیق برای سنجش بیان ژن در سطح رونویسی (transcription) بوده، و به محققان امکان کشف تغییراتی را میدهد که در بیماری، پاسخ به درمان‌، شرایط محیطی مختلف، و طیف وسیعی از طرح‌های مطالعاتی دیگر، ناشناخته بوده اند.

RNA-Seq به محققان اجازه می‌دهد تا هم ویژگی‌های شناخته‌شده و هم جدید را در یک سنجش واحد شناسایی کنند، که امکان تشخیص ایزوفرم‌های رونوشت (transcript)، فیوژن های ژنی، واریانت های تک نوکلئوتیدی (SNP) و … را بدون محدودیت دانش قبلی فراهم می‌کند.

همانطور که مشخص است، داده های RNA-Seq از خوانش های (read) با طول کوتاهmRNA  استفاده می کنند که عاری از DNA  غیر کد کننده اینترونیک می باشند. این خوانش ها، که در پایان کار به تعداد میلیون ها خوانش می رسد، می‌توانند در صورت موجود بودن ژنوم رفرنس، با آن هم ردیف شده یا در صورت عدم وجود ژنوم رفرنس، از نو (de novo) مونتاژ شوند تا یک نقشه توالی RNA تولید کنند که رونوشت را پوشش می‌دهد.

پیشنهاد: میزکار طراحی پرایمر وانیار امکان طراحی انواع مختلف پرایمرها را به سادگی و با چند کلیک فراهم کرده است. این پرایمرها تحت نظارت کارشناسان بیوانفورماتیک طراحی و اعتبارسنجی می شوند. برای مشاهد پلن های کاربری به صفحه طراحی پرایمر و پروب وارد شوید: ورود به صفحه طراحی پرایمر و پروب.

مزایای توالی یابی  RNA با NGS

RNA-Seq با توالی یابی نسل بعدی (NGS) به طور فزاینده ای روش انتخابی برای محققانی است که رونوشت را مطالعه می کنند. این ابزار مزایای بی شماری نسبت به آرایه های بیان ژن (gene expression arrays) ارائه می دهد.

• محدوده دینامیکی گسترده تر، اندازه گیری حساس تر و دقیق تر بیان ژن را امکان پذیر می کند.
• محدود به دانش قبلی نیست و می تواند برای هر گونه ای اعمال شود، حتی اگر توالی رفرنس در دسترس نباشد. برخلاف رویکردهای مبتنی بر هیبریداسیون، که ممکن است به پروب های مخصوص هر گونه‌ نیاز داشته باشند، RNA-Seq می‌تواند رونوشت‌هایی را از موجودات با توالی‌های ژنومی ناشناخته تشخیص دهد. این باعث می شود که اساساً برای تشخیص رونوشت های جدید، SNP ها یا سایر تغییرات برتری داشته باشد.

• به ازای هر نمونه، اغلب مزایایی را با قیمت قابل مقایسه یا پایین‌تر نسبت به بسیاری از آرایه‌ها ارائه می‌کند.

از جمله برتری های RNA-Seq میتوان به سیگنال پس‌زمینه پایین اشاره کرد. توالی‌های cDNA مورد استفاده در RNA-Seq  را می‌توان به مناطق هدف روی ژنوم مَپ (map) کرد، که حذف نویز آزمایش را آسان می‌کند.

علاوه بر این، مسائل مربوط به کراس-هیبریداسیون یا هیبریداسیون غیر استاندارد، که می‌تواند آزمایش‌های ریزآرایه (microarray) را دچار اختلال کند، در آزمایش‌های RNA-Seq مطرح نیست. به علاوه، داده های ریزآرایه فقط به صورت مقادیری نسبت به سایر سیگنال های شناسایی شده در آرایه نمایش داده می شوند، در حالی که داده های RNA-Seq قابل اندازه گیری هستند. همچنین،  RNA-Seq فاقد مشکلات ریزآرایه ها در تشخیص سطوح رونویسی بسیار بالا یا بسیار پایین می باشد.

روشهای متداول تعیین توالی RNA

• توالی یابی mRNA (mRNA-Seq)
• توالی یابی کل محتوای RNA (Total RNA-Seq) که RNA های کدکننده (coding) و چندین فرم از  RNAغیر کد کننده را تعیین توالی میکند.
• توالی یابی هدفمند RNA (Targeted RNA-Seq) که برای انتخاب و توالی یابی رونوشت های خاص RNA، یک روش بسیار دقیق به حساب می آید.
• توالی یابی RNA برای سلولِ واحد (Single-Cell RNA-Seq) که ترنسکریپتوم سلول های منفرد را در بافت‌های پیچیده بررسی می کند و تصویری با وضوح بالا از تنوع سلول به سلول ارائه می دهد.
• RNA Exome Capture که فقط نواحی کدکننده از ترنسکریپتوم را بررسی میکند.
• توالی یابی RNAهای کوچک (Small RNA-Seq) که برای جداسازی و توالی یابی RNA هایی مانند  microRNA (miRNA)  به کار میرود.
• پروفایلینگ ریبوزوم (Ribosome Profiling) که به عنوان Ribo-Seq یا ART-Seqهم شناخته میشود، روشی مبتنی بر توالی یابی عمیق قطعات mRNA محافظت شده با ریبوزوم است. پروفایلینگ ریبوزوم، یک عکس فوری از تمام ریبوزوم های فعال در یک سلول در یک نقطه زمانی خاص ارائه می دهد که به محققان کمک می کند تا مشخص کنند کدام پروتئین به طور فعال در یک سلول ترجمه می شود.

پیشنهاد: میزکار آنالیز نتایج توالی یابی سنگر امکان آنالیز توالی های مختلف را به سادگی و با چندکلیک فراهم کرده است. نتایج توسط کارشناسان بیوانفورماتیک وانیار گزارش و تایید می شوند. برای مشاهد پلن های کاربری به صفحه آنالیز نتایج توالی یابی سنگر وارد شوید: ورود به صفحه آنالیز نتایج توالی یابی سنگر.

آماده سازی کتابخانه برای توالی یابی RNA

پس از استخراج RNA و کنترل کیفیت آن، نوبت به آماده سازی کتابخانه های RNA-Seq می رسد. انواع واکنش مربوط به مراحل آماده سازی می‌تواند بسته به روش ساخت کتابخانه مورد استفاده و نوع  RNAمورد مطالعه متفاوت باشد، با این حال اصول مولکولی زیربنایی این مراحل یکسان هستند.

واکنش‌های زیر معمولاً در تهیه کتابخانه RNA-Seq استفاده می‌شوند:

رونویسی معکوس (reverse transcription)

رونویسی معکوس (reverse transcription) یا سنتز رشته اول، که به تولید یک مولکول DNA مکمل از روی الگوی RNA، توسط آنزیمی به نامReverse Transcriptase  اشاره دارد. سنتز رشته اول میتواند از طریق رونویسی معکوس با پرایمر حاوی اولیگو-dT (پرایمر به طور خاص به دم پلی-A در انتهای 3’ از RNA وصل می شود) یا رونویسی معکوس تصادفی (پرایمرهای تصادفی در امتداد الگوی RNA هیبرید می شوند) انجام شود.

حذف الگوی RNA و سنتز رشته دوم

حذف الگوی RNA و سنتز رشته دوم (اضافه شدن نوکلئوتیدهای مکمل با استفاده از DNA پلیمراز)

تعمیر انتهایی و لیگاسیون

سنتز رشته اول و دوم، سبب ایجاد DNA دو رشته ای با انتهای تک رشته می شود. بنابراین اغلب برای آماده سازیDNA دو رشته ای جهت اتصال آداپتور، فرآیندی به نام تعمیر انتهایی به کار می رود (شکل پایین). یک مخلوط آنزیمی معمولی ممکن است، برای مثال، حاوی DNA پلیمراز T4 و پلی نوکلئوتید کیناز T4 (PNK) باشد. DNA پلیمراز T4 در حضور dNTP می تواند انتهای آزاد سر 5’ را پر کرده و انتهای آزاد سر 3’ را تا کوتاه کند تا انتهای صاف ایجاد شود.

سپس T4 PNK می تواند نوکلئوتید انتهای 5’ را فسفریله کند. مرحله ی بعد، A-tailing نیز به پلیمراز نیاز دارد. Taq DNA پلیمراز رایج ترین است زیرا دارای فعالیت ترانسفراز انتهایی است و به طور طبیعی یک آدنین انتهایی 3’ بر جای می گذارد.

استفاده از هر یک این دست پلیمرازها انتهای A-tailed را ایجاد می کند که مکمل آداپتورهای توالی استاندارد هستند. افزودن آداپتور در این مرحله فقط نیاز به انکوباسیون با T4 DNA  لیگاز دارد. این آنزیم هر دو انتهای صاف و به اصطلاح «چسبنده» را به هم می‌پیوندد.

همچنین انواع دیگری از “تعمیر انتهایی” در آماده سازی کتابخانه های RNA-Seq استفاده می شود. موضوع اصلی این است که انتها های آزاد برداشته یا پر می شوند. این کار بیشتر روی DNA انجام می شود، اما RNA نیز می تواند تحت تعمیر نهایی قرار گیرد.

تکثیر با PCR

PCR آخرین مرحله در آماده سازی اکثر کتابخانه های NGS است. در طی این مرحله، کتابخانه ها برای کنترل کیفیت و در نهایت توالی یابی، تکثیر می شوند.