RT-PCR و Real-time PCR به زبان ساده، همراه با آموزش طراحی پرایمر

افتراق RT-PCR از Real-time PCR

ابتدا قصد داریم به این موضوع بپردازیم که RT PCR مخفف Real Time PCR نیست 😎

در بسیاری از آزمایشگاه‌های مولکولی و متون آکادمیک، روش‌های RT-PCR و Real-time PCR به‌دلیل شباهت حروف‌چینی «RT» و کاربردهای نزدیک، به‌اشتباه یکسان فرض می‌شوند.  برای رفع این سردرگمی، دستورالعمل‌های MIQE (منتشرشده در Clinical Chemistry | سال ۲۰۰۹) در بند ۱.۱ خود تأکید می‌کنند که:

1. فقط از RT‑PCR برای واکنش‌های PCR با مرحله رونویسی معکوس (Reverse Transcription PCR) استفاده شود.
2. واکنش‌های PCR با نشانگر فلورسنت باید با اصطلاح Real‑time PCR مشخص گردند.
3. در مواردی که هر دو مرحله رونویسی معکوس و پایش لحظه‌ای مدنظر است، از عنوان RT‑qPCR استفاده شود.

این نام‌گذاری استاندارد باعث افزایش شفافیت در گزارش نتایج، جلوگیری از ابهام در تفسیر داده‌های فلورسانس و تضمین رعایت کنترل‌های کیفی می‌شود.

در ادامه مقاله، شما را بیشتر با تکنیک RT-PCR و تکنولوژی ریل تایم آشنا می‌کنیم.

فیلم آموزش طراحی پرایمر برای RT-PCR و qPCR

کلیک کنید

RT-PCR چیست؟

آنزیم ترانسکریپتاز معکوس (Reverse Transcriptase) در سال ۱۹۷۰ کشف شد و همین موضوع زمینه را برای توسعه تکنیک PCR رونویسی معکوس (RT-PCR) فراهم کرد. در RT-PCR از RNA به‌عنوان الگویی برای تولید DNA مکمل یا cDNA استفاده می‌شود؛ درواقع به این صورت که با اثردهی آنزیم ترانسکریپتاز معکوس روی RNA، یک کپی تک رشته‌ای از DNA یعنی cDNA تولید می‌شود و سپس همین cDNA می‌تواند توسط یک DNA پلیمراز تکثیر شده و DNA دو رشته‌ای تولید شود. از اینجا به‌بعد، یک فرایند تکثیر مبتنی بر PCR استاندارد داریم.

تکنیک RT-PCR می‌تواند برای شناسایی انواع RNA شامل mRNA ،rRNA ،microRNA و RNAهای طویل غیرکدکننده (lncRNA) استفاده شود.

کاربردهای RT-PCR

⭕ در صورتی‌ که مطالعه شما روی مولکول RNA از نوع کیفی (qualitative) باشد، به آن End-point RT-PCR می‌گوییم و هیچ پایش فلورسانس در حین واکنش انجام نمی‌گیرد. این تکنیک برای تشخیص حضور RNA در نمونه‌های زیستی استفاده می‌شود و امکان بررسی وجود/عدم وجود ویروس‌ها یا بیان/عدم بیان ژن‌های خاص را فراهم می‌کند. به این منظور، محصول RT-PCR را روی ژل ران کرده و حضور یا عدم حضور توالی هدف را بررسی می‌کنیم.

از انواع کاربرد End-point RT-PCR، می‌توان به موارد زیر اشاره کرد:

• تشخیص وجود یا عدم وجود mRNA ژن‌های خاص در یک نمونه، که نشان می‌دهد یک ژن بیان شده‌است یا خیر. مثال: تشخیص بیان انکوژن‌ها یا ژن‌های سرکوبگر تومور (TSG) در سلول‌های سرطانی
• شناسایی RNA ویروسی: در تشخیص آلودگی‌هایی مانند COVID-19 (SARS-CoV-2) و HCV می‌توان از RT-PCR استفاده کرد. این تکنیک می‌تواند RNA ویروس‌ها را در نمونه‌ شناسایی کند.

⭕ اگر مطالعه شما روی RNA به‌صورت کمی (quantitative) باشد، لازم است بعد از ساخت cDNA با آنزیم RT، از تکنولوژی Real-time بهره ببرید. در این صورت، از RT-qPCR به معنای Quantitative Reverse Transcription PCR استفاده کرده‌اید، یعنی تبدیل RNA به cDNA (مرحله RT) و سپس تکثیر و اندازه‌گیری کمی cDNA در دستگاه ریل تایم.

RT-qPCR به‌دلیل ویژگی کمی و حساسیت بالا در موارد زیر کاربرد گسترده‌ای دارد:

تحلیل دقیق بیان ژن در شرایط مختلف – مانند تغییرات بیان ژن در پاسخ به داروها، شرایط استرسی، و بیماری‌ها.

مطالعات سینتیک و بار ویروسی  – تکنیک RT-qPCR می‌تواند مقدار ویروس را در نمونه اندازه‌گیری کند، نه فقط حضور یا عدم حضور آن را.

اعتبارسنجی دیتای RNA-seq و Microarray – برای هر مطالعه RNA-seq یا میکرواری، توصیه می‌شود حداقل ۵ تا ۱۰ ژن DE (یعنی ژنی که در آنالیز داده‌ها، اختلاف معناداری در سطح بیانش بین دو یا چند گروه پیدا شده) با RT-qPCR اعتبارسنجی شوند تا قابلیت اعتماد به نتایج افزایش یابد.

Real-time PCR چیست؟

ریل تایم PCR یک اصطلاح کلی است و به هر روش PCR اشاره می‌کند که در آن پیشرفت واکنش (تکثیر DNA) در زمان واقعی مانیتور می‌شود. به این معنا که ما فرآیند تکثیر DNA را در لحظه، در هر سیکل، رصد می‌کنیم و برای این منظور از رنگ‌های فلورسنت یا پروب استفاده می‌کنیم.

نتایج ریل تایم می‌تواند هم به‌صورت کیفی (حضور یا عدم حضور یک توالی) و هم کمی باشد، اما از آنجا که در اکثر مواقع از Real-time PCR برای اندازه‌گیری کمی استفاده می‌شود، دو اصطلاح qPCR (به معنی PCR کمی) و Real-time PCR در عمل مترادف شده‌اند.

روش‌های تشخیص در Real-time PCR

تکنولوژی ریل تایم از روش‌های مختلفی برای تشخیص و اندازه‌گیری DNA در لحظه استفاده می‌کند که بر پایه سیگنال‌های فلورسنت عمل می‌کنند. این تکنیک‌ها شامل پروب‌ها و رنگ‌های فلورسنتی هستند که در طول واکنش PCR سیگنال تولید کرده و توسط دستگاه Real-Time PCR شناسایی می‌شوند.

پیشنهاد: دوره جامع طراحی پرایمر یک فرصت طلایی برای یادگیری طراحی پرایمر به صورت حرفه‌ای در روش‌های RT-PCR و ریل تایم است. فرصتی بی‌نظیر جهت فراگیری طراحی پرایمر برای انواع روش‌های PCR 😊

ورود به دوره

چند نمونه از روش‌های تشخیص در Real-Time PCR عبارتند از:

پروب‌های TaqMan

الیگونوکلئوتیدهایی هستند که با رنگ گزارشگر فلورسنت (Reporter یا R) در یک انتها و رنگ خاموش‌کننده (Quencher یا Q) در انتهای دیگر برچسب‌گذاری شده‌اند. پروب در طی واکنش PCR به ناحیه خاصی از DNA هدف هیبرید یا متصل می‌شود. هنگامی که پروب توسط آنزیم پلیمراز در طول مرحله گسترش (Extension) شکافته می‌شود، رنگ R از Q جدا شده و نور فلورسانس منتشر می‌کند که می‌تواند توسط دستگاه تشخیص داده شود. مقدار فلورسانس با مقدار DNA هدف متناسب است.

سایبرگرین (SYBR Green)

سایبرگرین یک رنگ فلورسنت است که به DNA دو رشته‌ای (dsDNA) متصل می‌شود. در طی واکنش PCR، هرچقدر که میزان بیشتری dsDNA تولید شود، SYBR Green بیشتری هم به آن متصل شده و نور فلورسانس بیشتری هم منتشر می‌شود. بنابراین، مقدار فلورسانس با مقدار dsDNA متناسب است. با این حال، SYBR Green نمی‌تواند بین محصولات اختصاصی و غیراختصاصی تمایز قائل شود، بنابراین برای تأیید اختصاصیت تکثیر، آنالیز منحنی ذوب (Melting Curve) مورد نیاز است.

 فانوس‌های مولکولی (Molecular Beacons)

فانوس‌های مولکولی پروب‌های اولیگونوکلئوتیدی هستند که یک ساختار سنجاق‌سر را با یک رنگ گزارشگر در یک سر و یک رنگ خاموش‌کننده در انتهای دیگر تشکیل می‌دهند. پروب هنگامی که در این کانفورماسیون قرار دارد، نور فلورسانس منتشر نمی‌کند. با این حال، هنگامی که پروب در طول واکنش PCR به DNA هدف هیبرید می‌شود، ساختار آن باز شده و رنگ گزارشگر را از رنگ خاموش‌کننده جدا می‌کند و در نتیجه سیگنال فلورسانس می‌تواند توسط دستگاه تشخیص داده شود. مقدار نور فلورسانس با مقدار DNA هدف متناسب است.

در طول فاز Denaturation، فانوس مولکولی از ساختار Hairpin خود باز شده و به یک حالت تصادفی (Random Coil) درمی‌آید. در این فاز به‌دلیل دمای بالا و عدم هیبرید شدن به DNA هدف، سیگنال فلورسانس قوی نداریم. پس از هیبریداسیون فانوس مولکولی با هدف در مرحله Annealing، رنگ R و Q از هم جدا می‌شوند و رنگ گزارشگر فلورسانس ساطع می‌کند. فانوس‌های مولکولی بر خلاف پروب‌های TaqMan، در طول واکنش تکثیری دست نخورده باقی می‌مانند.

کاربردهای qPCR

در بخش‌های قبلی این مقاله، درباره RT-qPCR صحبت کردیم، روشی که طی آن ابتدا RNA را با آنزیم RT به cDNA تبدیل می‌کنیم و سپس روی آن با تکنیک ریل تایم سنجش کمی انجام می‌دهیم. اما در روش qPCR (بدون RT) سنجش کمی روی مولکول DNA انجام‌ می‌شود و نیازی به استفاده از آنزیم RT نیست.

روش qPCR برای اندازه‌گیری دقیق تعداد نسخه‌های DNA (مانند تشخیص تغییرات تعداد کپی (CNVs) در نمونه) استفاده می‌شود و به پژوهشگران امکان تحلیل کمی DNA را می‌دهد.

تکنیسین‌ها qPCR را به‌منظور بررسی اضافه یا حذف شدن نواحی خاصی از ژنوم (به‌طور مثال: اگزون‌ها) به کار می‌برند، مانند: بررسی افزایش تعداد کپی ژن HER2 در سرطان پستان.

طراحی پرایمر برای ریل تایم و RT-PCR

از برخی جهات، معیارهای طراحی پرایمر در RT-PCR (کیفی و کمی) و qPCR مشابه PCR استاندارد یا معمولی هستند، مانند طول پرایمر (معمولاً ۱۸ تا ۲۳ نوکلئوتید)، درصد GC (محدوده ۴۰ تا ۶۰ درصد)، پرهیز از ساختارهای دایمر و … . توصیه می‌کنیم به این منظور، مقاله “طراحی پرایمر چیست؟” را مطالعه کنید.

در ادامه این مقاله، مروری بر معیارها و استراتژی‌های طراحی پرایمر برای تکنیک‌های RT-PCR و Real-time PCR خواهیم داشت.

طراحی پرایمر در RT-PCR

چالش اساسی تکنیسین‌ها برای اجرای RT-PCR، وجود DNA ژنومی (gDNA) هنگام استخراج RNA از نمونه است (آلودگی gDNA). دو راهکار برای حذف gDNA از نمونه وجود دارد: استفاده از DNase برای شکستن DNA و طراحی پرایمرهایی که بین cDNA و gDNA تمایز قائل می‌شوند.

در ادامه، استراتژی‌های طراحی پرایمر را در تکنیک RT-PCR به شما معرفی می‌کنیم.

استراتژی درون اگزونی (Within Exon)

در این حالت هر دو پرایمر Forward و Reverse در یک اگزون قرار دارند که موجب تکثیر غیرقابل افتراق محصولات cDNA و gDNA خواهد شد. تصور کنید ژن مورد نظر شما اصلاً بیان نشده و RNA آن در نمونه وجود ندارد. اگر در این شرایط آلودگی gDNA داشته باشید، پرایمرها به DNA وصل شده و تکثیر رخ می‌دهد. اینجاست که به اشتباه نتیجه می‌گیرید ژن شما بیان دارد.

پوشش‌دهنده اینترون (Intron-Spanning)

پرایمرها روی دو اگزون جداگانه قرار گرفته‌اند و بین آن‌ها اینترون است. در این حالت، علاوه بر یک محصول PCR با اندازه cDNA مورد انتظار، اگر اندازه اینترون بین دو اگزون به‌اندازه کافی کوچک باشد، امپلیکون بلندتری از gDNA (نسبت به cDNA) تولید می‌شود.

پوشش‌دهنده اگزون (Exon-Spanning)

پرایمرها روی دو اگزون مختلف قرار می‌گیرند که حداقل با یک اگزون و دو اینترون از هم جدا شده‌اند.

اتصال اگزون به اگزون (Exon-Exon junction)

پرایمر Forward یا Reverse در محل اتصال بین دو اگزون قرار دارد، در حالی که پرایمر دوم ممکن است به‌طور کامل در داخل یک اگزون یا در یک اتصال اگزون به اگزون دیگر قرار بگیرد. توالی‌هایی از cDNA اما نه از gDNA با این استراتژی تکثیر خواهند شد.

🟥 توجه کنید که اگر قصد دارید از روش RT-PCR اندپوینت استفاده کنید، می‌توانید به‌راحتی محصولات تا سایز 1000bp را تولید کنید. حتی با استفاده از کیت‌ها و آنزیم‌های مناسب قادر به تولید امپلیکون‌های چند کیلوبایتی نیز هستید.

🟧 اما در صورتی‌که قصد دارید از تکنولوژی Real-time به‌منظور سنجش کمی بیان ژن استفاده کنید (RT-qPCR)، به‌شدت توصیه می‌شود که سایز محصول کوتاه (زیر 300bp) و Tm بین ۶۰ تا ۶۵ درجه (با اختلاف حداکثر دو درجه) باشد. دلیل این موضوع هم این است که در ریل‌تایم، سیگنال فلورسانس باید سریع و دقیق تشخیص داده شود و طولانی بودن محصول باعث کاهش کارایی واکنش (efficiency)، افت حساسیت و افزایش احتمال تولید محصولات غیراختصاصی می‌شود.

طراحی پرایمر در qPCR

در qPCR، مولکول ورودی مستقیما DNA است، در حالی که در RT-PCR اند-پوینت و RT-qPCR ابتدا RNA را به cDNA تبدیل می‌کنیم؛ بنابراین به حذف gDNA در qPCR نیاز نداریم.

سایر اصول طراحی پرایمر با روش RT-qPCR مشترک‌اند و اندازه‌ی امپلیکون برای حفظ بازده نزدیک به 100٪ و سیگنال دقیق، زیر 300bp، مشابه RT-qPCR توصیه می‌شود.

🟦 هنگام استفاده از پروب فلورسنت در تکنیک‌های کمی مانند qPCR یا RT-qPCR، باید پروب را به‌گونه‌ای طراحی کرد که به‌صورت اختصاصی به توالی هدف متصل شود تا سیگنالی دقیق و قابل اعتماد تولید گردد. یکی از نکات کلیدی در این طراحی، آن است که دمای ذوب پروب (Tm) معمولاً ۵ تا ۱۰ درجه سلسیوس بالاتر از پرایمرها باشد، تا اتصال پایدار و مؤثری پیش از اتصال پرایمرها برقرار شود.

مقایسه آنالیز داده در RT-PCR و Real-time PCR

در RT-PCR اندپوینت (کیفی)، آنالیز دیتا ساده است: محصول PCR روی ژل آگارز ران شده و با رنگ DNA مثل اتیدیوم بروماید مشاهده می‌شود. درواقع، فقط حضور یا عدم حضور باند (و اندازه‌اش) را بررسی می‌کنیم، پس تحلیل فقط کیفی است (بیان شده یا خیر).

اما در qPCR و RT-qPCR (تکنیک‌های کمی)، آنالیز دقیق‌تری نیاز داریم. در اینجا دستگاه Real-time PCR در هر سیکل، مقدار فلورسانس را اندازه‌گیری می‌کند. مهم‌ترین داده‌ای که از دستگاه می‌گیریم، Ct یا (Cycle threshold) است: تعداد سیکلی که در آن سیگنال از آستانه عبور می‌کند و به‌صورت معنی‌دار ثبت می‌شود.

برای تحلیل، معمولاً:

• اگر نسبی بررسی می‌کنید (مثلاً بیان یک ژن در تیمار نسبت به کنترل)، بایستی از روش‌هایی مثل ΔCt (اختلاف Ct ژن هدف و ژن مرجع) یا ΔΔCt (مقایسه بین گروه‌ها) استفاده کنید.
• اگر قصد دارید مطلق بررسی کنید (چند نسخه از یک ژن وجود دارد)، بایستی از Standard Curve استفاده کنید.

در نهایت، داده‌ها به‌صورت نمودار و Fold Change تفسیر می‌شوند، و صحت نتایج را باید با کنترل‌ها تأیید نمایید.

ورود به دوره بیوانفورماتیک پروتئین

ورود به دوره بیوانفورماتیک عمومی و کاربردی

جمع‌بندی و نتیجه‌گیری

در این مقاله، با نگاهی ساده اما علمی، تفاوت‌های کلیدی میان RT-PCR (مبتنی بر تبدیل معکوس RNA به cDNA) و Real-time PCR (با پایش لحظه‌ای فلورسانس و قابلیت اجرا روی DNA/RNA) را شفاف‌سازی کردیم. همچنین نشان دادیم که ترکیب این دو تکنیک، یعنی RT-qPCR، چگونه به یک ابزار دقیق در پژوهش‌های سنجش میزان بیان ژن تبدیل شده است. در ادامه نیز اصول طراحی پرایمر برای این روش‌ها را با تأکید بر پارامترهایی همچون اندازه امپلیکون، دمای ذوب، و راندمان واکنش مرور کردیم. آشنایی با این مفاهیم، گامی ضروری برای طراحی آزمایش‌های دقیق، تکرارپذیر و قابل استناد است.

اگه تجربه پیاده‌سازی این تکنیک‌های آزمایشگاهی رو داشتی، خوشحال میشیم با ما در بخش نظرات به اشتراک بگذاری 🙂

سوالات متداول