آموزش کامل NetMHCpan؛ از اجرای آنالیز تا تفسیر نتایج

NetMHCpan و نقش آن در ایمونوانفورماتیک

NetMHCpan یکی از شناخته‌شده‌ترین ابزارهای ایمونوانفورماتیک برای پیش‌بینی اتصال پپتیدها به مولکول‌های MHC کلاس I و ارزیابی احتمال ارائه آن‌ها به سلول‌های CD8+ T است. این ابزار با بهره‌گیری از مدل‌های یادگیری ماشین و مجموعه‌های گسترده داده‌های تجربی، امکان بررسی سریع تعداد زیادی پپتید را فراهم می‌کند و به پژوهشگران کمک می‌کند کاندیداهای مناسب را پیش از ورود به مراحل آزمایشگاهی شناسایی و اولویت‌بندی کنند.

اهمیت این موضوع از نقش MHC کلاس I در ارائه قطعات کوتاه پروتئینی روی سطح سلول ناشی می‌شود. این پپتیدها توسط سلول‌های CD8+ T بررسی می‌شوند و در صورت منشأ ویروسی، باکتریایی یا مرتبط با تغییرات سرطانی، می‌توانند زمینه‌ساز شکل‌گیری پاسخ ایمنی باشند. بنابراین، شناسایی پپتیدهایی که توانایی اتصال به MHC کلاس I و قرار گرفتن در مسیر ارائه آنتی‌ژن را دارند، یکی از موضوعات مهم در ایمونولوژی محاسباتی است.

بررسی تجربی تعداد زیادی پپتید می‌تواند زمان‌بر و پرهزینه باشد. NetMHCpan با پیش‌بینی محاسباتی این فرایند را ساده‌تر می‌کند و به‌جای بررسی آزمایشگاهی همه کاندیداها، مجموعه‌ای محدودتر از پپتیدهای اولویت‌دار را برای مطالعات بعدی در اختیار پژوهشگر قرار می‌دهد. به همین دلیل، این ابزار در حوزه‌هایی مانند طراحی واکسن، کشف اپی‌توپ، مطالعات بیماری‌های عفونی، کشف نئوآنتی‌ژن و ایمونوتراپی سرطان کاربرد گسترده‌ای پیدا کرده است.

در ادامه، نحوه عملکرد NetMHCpan، داده‌های مورد استفاده در مدل و تفاوت پیش‌بینی Binding با Antigen Presentation را بررسی می‌کنیم.

NetMHCpan چگونه کار می‌کند؟

NetMHCpan با بهره‌گیری از الگوریتم‌های یادگیری ماشین، تلاش می‌کند رفتار طبیعی مولکول‌های MHC کلاس I را در اتصال و ارائه پپتیدها شبیه‌سازی کند.

این ابزار برای انجام این پیش‌بینی، تنها به توالی پپتید اکتفا نمی‌کند؛ بلکه از حجم گسترده‌ای از داده‌های آزمایشگاهی و اطلاعات مربوط به الل‌های مختلف HLA نیز استفاده می‌کند. در طول سال‌ها، با اضافه شدن داده‌های جدید و توسعه مدل‌های یادگیری ماشین، دقت پیش‌بینی‌های NetMHCpan به‌طور قابل‌توجهی افزایش یافته است.

در این بخش، ابتدا با مهم‌ترین داده‌های مورد استفاده در این ابزار آشنا می‌شویم و سپس بررسی می‌کنیم که چرا NetMHCpan به‌عنوان یک ابزار Pan-specific شناخته می‌شود و چه تفاوتی میان پیش‌بینی اتصال پپتید و پیش‌بینی ارائه آنتی‌ژن وجود دارد.

داده‌هایی که مدل از آن‌ها یاد گرفته است

دقت بالای NetMHCpan تا حد زیادی به کیفیت داده‌های مورد استفاده برای آموزش مدل بستگی دارد. در نسخه‌های جدید این ابزار، به‌ویژه NetMHCpan 4.2، پژوهشگران مدل را با ترکیبی از دو نوع دیتای اصلی آموزش داده‌اند: Binding Affinity (BA) و Eluted Ligand (EL). این دو مجموعه دیتا، هرکدام جنبه متفاوتی از فرآیند ارائه آنتی‌ژن را توصیف می‌کنند و استفاده هم‌زمان از آن‌ها به مدل کمک کرده است تا پیش‌بینی‌های خود را به شرایط واقعی بدن نزدیک‌تر کند.

Binding Affinity (BA) شامل داده‌هایی است که میزان قدرت اتصال یک پپتید به یک مولکول MHC کلاس I را در شرایط آزمایشگاهی اندازه‌گیری می‌کنند. این داده‌ها سال‌ها به‌عنوان پایه اصلی توسعه ابزارهای پیش‌بینی اتصال مورد استفاده قرار گرفته‌اند و اطلاعات ارزشمندی درباره تمایل اتصال پپتیدها به الل‌های مختلف HLA فراهم می‌کنند.

در مقابل، داده‌های Eluted Ligand (EL) از طریق آزمایش‌های ایمونوپروتئومیکس و طیف‌سنجی جرمی (LC-MS/MS) به‌دست می‌آیند. در این روش، پپتیدهایی که به‌طور طبیعی روی مولکول‌های MHC کلاس I قرار گرفته‌اند، استخراج و شناسایی می‌شوند. بنابراین، این داده‌ها علاوه بر اطلاعات مربوط به اتصال، بازتاب‌دهنده فرآیندهای زیستی دیگری مانند پردازش آنتی‌ژن و ارائه طبیعی آن نیز هستند و تصویر واقع‌بینانه‌تری از آنچه در سلول رخ می‌دهد ارائه می‌کنند.

چرا NetMHCpan یک ابزار Pan-specific است؟

یکی از مهم‌ترین ویژگی‌های NetMHCpan، توانایی آن در پیش‌بینی برای طیف وسیعی از الل‌های HLA کلاس I است. بسیاری از ابزارهای قدیمی تنها برای الل‌هایی عملکرد مناسبی داشتند که داده‌های آزمایشگاهی فراوانی درباره آن‌ها در دسترس بود. در مقابل، NetMHCpan با یادگیری الگوهای مشترک میان الل‌های مختلف، قادر است حتی برای الل‌هایی که داده‌های محدودی دارند نیز پیش‌بینی قابل قبولی ارائه دهد.

همین قابلیت باعث شده است که NetMHCpan در مطالعات مربوط به جمعیت‌های مختلف انسانی، طراحی واکسن‌های جهانی و پژوهش‌هایی که با تنوع ژنتیکی بالای HLA سروکار دارند، به یکی از پرکاربردترین ابزارهای ایمونوانفورماتیک تبدیل شود. همچنین، پژوهشگران در نسخه 4.2 با افزودن داده‌های آموزشی جدید، پوشش اللی مدل را نسبت به نسخه‌های پیشین افزایش داده‌اند؛ موضوعی که در بخش مربوط به تغییرات نسخه 4.2 با جزئیات بیشتری بررسی خواهیم کرد.

تفاوت Prediction of Binding با Prediction of Presentation

اگرچه این دو مفهوم گاهی به‌جای یکدیگر استفاده می‌شوند، اما تفاوت مهمی با هم دارند.

Binding Prediction تنها احتمال اتصال یک پپتید به مولکول MHC کلاس I را ارزیابی می‌کند. به عبارت دیگر، این پیش‌بینی پاسخ می‌دهد که آیا یک پپتید از نظر ویژگی‌های مولکولی می‌تواند به شیار اتصال MHC متصل شود یا خیر.

اما Antigen Presentation Prediction یک گام فراتر می‌رود. در این حالت، مدل علاوه بر قدرت اتصال، عواملی مانند پردازش آنتی‌ژن و احتمال ارائه طبیعی پپتید روی سطح سلول را نیز در نظر می‌گیرد. به همین دلیل، پیش‌بینی ارائه آنتی‌ژن معمولاً به شرایط زیستی واقعی نزدیک‌تر است و برای بسیاری از کاربردهای ایمونوانفورماتیک، از جمله طراحی واکسن و شناسایی اپی‌توپ‌های سلول‌های T، ارزش بیشتری دارد.

در نسخه‌های جدید NetMHCpan، به‌ویژه نسخه 4.2، با استفاده از داده‌های EL، ویژگی‌های ساختاری جدید و روش‌های یادگیری پیشرفته، تمرکز مدل از پیش‌بینی صرفِ اتصال به سمت پیش‌بینی دقیق‌تر ارائه آنتی‌ژن و در نهایت شناسایی اپی‌توپ‌های CD8+ T حرکت کرده است.

مروری بر نسخه‌های قبلی NetMHCpan

NetMHCpan از زمان معرفی تاکنون به‌طور مداوم توسعه یافته است و پژوهشگران هر نسخه را با هدف افزایش دقت پیش‌بینی، گسترش پوشش الل‌های HLA و نزدیک‌تر کردن مدل به فرآیندهای واقعی سیستم ایمنی ارائه کرده‌اند. اگرچه اصول کلی عملکرد این ابزار در طول سال‌ها ثابت مانده، اما داده‌های آموزشی، معماری مدل و روش‌های یادگیری آن به مرور تکامل یافته‌اند. در این بخش، نگاهی کوتاه به نسخه‌های قبلی NetMHCpan خواهیم داشت تا جایگاه نسخه 4.2 را بهتر درک کنیم.

NetMHCpan 4.0

نسخه NetMHCpan 4.0 نقطه عطفی در توسعه این ابزار محسوب می‌شود، زیرا برای نخستین بار علاوه بر داده‌های BA، از داده‌های EL نیز برای آموزش مدل استفاده شد. این تغییر باعث شد پیش‌بینی‌ها تنها بر اساس قدرت اتصال پپتید به MHC انجام نشوند، بلکه فرآیند طبیعی ارائه آنتی‌ژن نیز بهتر در مدل بازتاب پیدا کند. در نتیجه، دقت پیش‌بینی اپی‌توپ‌ها نسبت به نسخه‌های پیشین بهبود یافت و NetMHCpan به ابزاری کاربردی‌تر برای مطالعات ایمونوانفورماتیک تبدیل شد.

NetMHCpan 4.1

نسخه NetMHCpan 4.1 با معرفی چارچوب NNAlign_MA گام مهم دیگری در توسعه این ابزار برداشت. این چارچوب امکان استفاده هم‌زمان از داده‌های Single-Allele (SA) و Multi-Allele (MA) را فراهم کرد و با بهبود فرآیند Motif Deconvolution، دقت مدل در تحلیل داده‌های ایمونوپروتئومیکس افزایش یافت. این نسخه برای سال‌ها یکی از پرکاربردترین ابزارهای پیش‌بینی اتصال پپتید و ارائه آنتی‌ژن در پژوهش‌های ایمونولوژی و طراحی واکسن بود.

NetMHCpan 4.2 چه بهبودهایی نسبت به نسخه‌های قبلی دارد؟

NetMHCpan 4.2 جدیدترین نسخه این ابزار است که در سال ۲۰۲۵ معرفی شد و بر پایه NetMHCpan 4.1 توسعه یافته است. هدف اصلی این نسخه، بهبود پیش‌بینی Antigen Presentation و شناسایی دقیق‌تر اپی‌توپ‌های CD8+ T است. برای رسیدن به این هدف، داده‌های آموزشی جدید، ویژگی‌های ساختاری و روش Transfer Learning به مدل اضافه شده و پوشش آلل‌های HLA نیز افزایش یافته است.

افزایش داده‌های آموزشی Binding Affinity و Eluted Ligand

یکی از مهم‌ترین تغییرات در NetMHCpan 4.2، گسترش قابل‌توجه مجموعه داده‌های آموزشی است. پژوهشگران برای آموزش این نسخه، داده‌های جدید BA و EL را به مدل اضافه کرده‌اند تا شبکه عصبی بتواند الگوهای متنوع‌تری از تعامل میان پپتیدها و مولکول‌های MHC کلاس I را یاد بگیرد. افزایش این داده‌ها باعث شده است مدل در مواجهه با آلل‌های مختلف HLA و انواع گوناگون پپتیدها، پیش‌بینی‌های دقیق‌تر و قابل‌اعتمادتری ارائه دهد.

نکته مهم این است که استفاده هم‌زمان از داده‌های BA و EL، مدل را از یک ابزار صرفاً پیش‌بینی‌کننده اتصال پپتید، به ابزاری نزدیک‌تر به فرآیند واقعی ارائه آنتی‌ژن تبدیل کرده است. به همین دلیل، نسخه 4.2 نسبت به نسخه‌های قدیمی‌تر عملکرد بهتری در شناسایی اپی‌توپ‌های واقعی نشان می‌دهد.

افزایش پوشش الل‌های HLA

یکی دیگر از بهبودهای مهم این نسخه، افزایش تعداد آلل‌های HLA کلاس I است که مدل برای آن‌ها آموزش دیده است. از آنجا که تنوع ژنتیکی HLA در جمعیت‌های انسانی بسیار زیاد است، پوشش تعداد بیشتری از آلل‌ها باعث می‌شود NetMHCpan در مطالعات مربوط به جمعیت‌های مختلف، عملکرد دقیق‌تر و قابل‌اعتمادتری داشته باشد.

این گسترش داده‌های آموزشی به‌ویژه برای آلل‌هایی که پیش‌تر اطلاعات آزمایشگاهی محدودی درباره آن‌ها وجود داشت، اهمیت زیادی دارد. در نتیجه، پژوهشگران می‌توانند در پروژه‌های طراحی واکسن، ایمونوتراپی یا مطالعات بیماری‌های عفونی، دامنه وسیع‌تری از آلل‌های HLA را مورد بررسی قرار دهند.

اضافه شدن ویژگی‌های ساختاری

یکی دیگر از بهبودهای مهم این نسخه، افزایش تعداد آلل‌های HLA کلاس I است که مدل برای آن‌ها آموزش دیده است. از آنجا که تنوع ژنتیکی HLA در جمعیت‌های انسانی بسیار زیاد است، پوشش تعداد بیشتری از آلل‌ها باعث می‌شود NetMHCpan در مطالعات مربوط به جمعیت‌های مختلف، عملکرد دقیق‌تر و قابل‌اعتمادتری داشته باشد.

این گسترش داده‌های آموزشی به‌ویژه برای آلل‌هایی که پیش‌تر اطلاعات آزمایشگاهی محدودی درباره آن‌ها وجود داشت، اهمیت زیادی دارد. در نتیجه، پژوهشگران می‌توانند در پروژه‌های طراحی واکسن، ایمونوتراپی یا مطالعات بیماری‌های عفونی، دامنه وسیع‌تری از آلل‌های HLA را مورد بررسی قرار دهند.

استفاده از Transfer Learning

یکی از نوآوری‌های مهم NetMHCpan 4.2، استفاده از Transfer Learning است. در این روش، مدل ابتدا با مجموعه‌داده‌های بزرگ آموزش می‌بیند و سپس دانش به‌دست‌آمده را برای حل مسائل تخصصی‌تر به کار می‌گیرد. این رویکرد به‌ویژه زمانی مفید است که داده‌های آموزشی برای یک کاربرد خاص محدود باشند.

در نسخه 4.2، پژوهشگران از این تکنیک برای بهبود پیش‌بینی اپی‌توپ‌های CD8+ T استفاده کرده‌اند. نتایج نشان می‌دهد که این روش می‌تواند عملکرد مدل را در شناسایی اپی‌توپ‌های مرتبط با پاتوژن‌ها و نئوآنتی‌ژن‌های سرطانی بهبود بخشد و دقت پیش‌بینی آن را نسبت به نسخه‌های قبل افزایش دهد.

سه حالت مختلف پیش‌بینی در NetMHCpan 4.2

یکی از قابلیت‌های جدید این نسخه، ارائه مدل‌های اختصاصی برای سناریوهای مختلف زیستی است. به‌جای استفاده از یک مدل واحد برای همه کاربردها، NetMHCpan 4.2 امکان انجام پیش‌بینی در سه حالت مختلف را فراهم می‌کند:

• Antigen Presentation؛ برای پیش‌بینی احتمال ارائه طبیعی پپتیدها توسط مولکول‌های MHC کلاس I.
• Pathogen Epitope Prediction؛ برای شناسایی اپی‌توپ‌های مشتق‌شده از عوامل بیماری‌زا مانند ویروس‌ها و باکتری‌ها.
• Neoepitope Prediction؛ برای شناسایی نئوآنتی‌ژن‌های حاصل از جهش‌های سرطانی که در مطالعات ایمونوتراپی سرطان اهمیت ویژه‌ای دارند.

این تفکیک باعث شده است کاربران بتوانند متناسب با نوع پروژه خود، از مدلی استفاده کنند که برای همان کاربرد بهینه‌سازی شده است و در نتیجه، پیش‌بینی‌های دقیق‌تری دریافت کنند.

در مجموع، مهم‌ترین تغییرات NetMHCpan 4.2 را می‌توان در پنج محور خلاصه کرد:

گسترش داده‌های BA و EL
افزایش پوشش آلل‌های HLA
افزودن ویژگی‌های ساختاری
استفاده از Transfer Learning
ارائه مدل‌های اختصاصی برای Antigen Presentation ، Pathogen Epitope و Neoepitope

در نتیجه، نسخه 4.2 صرفاً یک نسخه با داده‌های بیشتر نیست؛ بلکه تلاش می‌کند با ترکیب داده‌های تجربی، اطلاعات ساختاری و روش‌های یادگیری پیشرفته، پیش‌بینی ارائه آنتی‌ژن و اپی‌توپ را به شرایط زیستی واقعی نزدیک‌تر کند.

چگونه از NetMHCpan 4.2 استفاده کنیم؟

برای انجام یک تحلیل، کافی است داده‌های ورودی، الل یا الل‌های HLA موردنظر و برخی تنظیمات اختیاری را مشخص کرده و درخواست خود را برای پردازش ارسال کنید. در این بخش، برای آشنایی عملی با محیط ابزار، مراحل کار با NetMHCpan 4.2 را با استفاده از یک مثال واقعی مرور می‌کنیم.

در این آموزش از توالی پروتئینی Proteinase 3CL-Pro (Main Protease یا Mpro) ویروس SARS-CoV-2 استفاده می‌کنیم. این آنزیم یکی از پروتئین‌های کلیدی ویروس است که با برش پلی‌پروتئین‌های ویروسی، نقش مهمی در تکثیر ویروس ایفا می‌کند. به همین دلیل، 3CL-Pro علاوه بر اینکه هدف مهمی در طراحی داروهای ضدویروسی محسوب می‌شود، در مطالعات ایمونوانفورماتیک نیز برای شناسایی اپی‌توپ‌های سلول T و طراحی واکسن مورد توجه قرار گرفته است.

در این مثال، از توالی FASTA مربوط به پروتئین Proteinase 3CL-Pro استفاده می‌کنیم:

>QHD43415_5
SGFRKMAFPSGKVEGCMVQVTCGTTTLNGLWLDDVVYCPR
HVICTSEDMLNPNYEDLLIRKSNHNFLVQAGNVQLRVIGH
SMQNCVLKLKVDTANPKTPKYKFVRIQPGQTFSVLACYNG
SPSGVYQCAMRPNFTIKGSFLNGSCGSVGFNIDYDCVSFC
YMHHMELPTGVHAGTDLEGNFYGPFVDRQTAQAAGTDTTI
TVNVLAWLYAAVINGDRWFLNRFTTTLNDFNLVAMKYNYE
PLTQDHVDILGPLSAQTGIAVLDMCASLKELLQNGMNGRT
ILGSALLEDEFTPFDVVRQCSGVTFQ 

مرحله اول؛ وارد کردن داده‌های ورودی

اولین مرحله در استفاده از NetMHCpan 4.2، مشخص کردن نوع داده‌ای است که قصد تحلیل آن را دارید. این ابزار سه نوع ورودی را پشتیبانی می‌کند که هر کدام برای سناریوهای متفاوتی طراحی شده‌اند.

• FASTA: برای تحلیل یک یا چند توالی پروتئینی کامل
• Peptide: برای بررسی فهرستی از پپتیدهای از پیش تعیین‌شده
• Peptide-MHC: برای تحلیل جفت‌های مشخص پپتید و آلل

در این آموزش، چون یک توالی کامل پروتئینی در اختیار داریم، گزینه FASTA را انتخاب کرده و توالی Proteinase 3CL-Pro را در کادر مربوطه وارد می‌کنیم.

در صورت نیاز می‌توان گزینه Context Encoding را نیز فعال کرد. این قابلیت اطلاعات مربوط به محیط اطراف هر پپتید در پروتئین اولیه را در اختیار مدل قرار می‌دهد تا فرآیند طبیعی پردازش و ارائه آنتی‌ژن با دقت بیشتری شبیه‌سازی شود. زمانی که ورودی از نوع FASTA باشد، این اطلاعات به‌صورت خودکار از توالی پروتئین استخراج می‌شود و نیازی به وارد کردن دستی آن نیست.

NetMHCpan از کد تک‌حرفی استاندارد آمینواسیدها استفاده می‌کند. در صورتی که کاراکتر نامعتبری در توالی وجود داشته باشد، ابزار آن را به حرف X (آمینواسید ناشناخته) تبدیل می‌کند. همچنین در هر درخواست، حداکثر ۵۰۰ توالی قابل ارسال است و طول هر توالی باید بین ۸ تا ۲۰٬۰۰۰ آمینواسید باشد.

از آنجا که نوع ورودی را FASTA انتخاب کرده‌ایم، باید طول پپتیدهای موردنظر نیز مشخص شود. ابزار به‌صورت پیش‌فرض پروتئین را به پپتیدهای هم‌پوشان ۹ آمینواسیدی (9-mer) تقسیم کرده و هر یک را به‌صورت جداگانه تحلیل می‌کند. این طول، رایج‌ترین اندازه پپتیدهای ارائه‌شده توسط مولکول‌های MHC کلاس I است و در اغلب مطالعات نیز به‌عنوان مقدار پیش‌فرض استفاده می‌شود.

مرحله دوم؛ انتخاب مولکول‌های MHC

در مرحله بعد باید مشخص کنیم که پیش‌بینی برای کدام مولکول یا مولکول‌های MHC کلاس I انجام شود.

رویکرد پوشش جمعیت جهانی (توصیه‌شده برای طراحی واکسن)
اگر هدف شما طراحی واکسن یا دارویی است که روی بیشتر مردم دنیا مؤثر باشد، باید فراوان‌ترین HLAها در جمعیت جهان را انتخاب کنید. چه اللهایی؟ مجموعه استاندارد ۱۲ سوپرتا‌یپ HLA کلاس I بیش از ۹۰ درصد جمعیت جهان را پوشش می‌دهند.

مهم‌ترین الل‌های این گروه عبارتند از:

HLA-A02:01,
HLA-A01:01, HLA-A03:01, HLA-A24:02, HLA-A11:01

برای این مثال، الل HLA-A02:01 و HLA-A01:01 را انتخاب می‌کنیم. می‌توانید آن‌ها را از فهرست موجود انتخاب کنید یا نام الل‌ها را مستقیماً در کادر مربوطه وارد نمایید. NetMHCpan در هر درخواست امکان بررسی حداکثر ۲۰ الل را فراهم می‌کند.

همچنین، در صورت در اختیار داشتن توالی کامل یک مولکول MHC، می‌توان آن را در قالب FASTA وارد کرد. این قابلیت بیشتر در مطالعات پژوهشی و هنگام بررسی الل‌های کمتر شناخته‌شده کاربرد دارد.

نکته: اگر نوع ورودی Peptide-MHC باشد، این بخش در رابط کاربری نمایش داده نمی‌شود؛ زیرا الل مربوط به هر پپتید از قبل در فایل ورودی مشخص شده است.

مرحله سوم؛ انجام تنظیمات پیشرفته

NetMHCpan 4.2 چندین گزینه اختیاری در اختیار کاربر قرار می‌دهد تا تحلیل دقیق‌تر و متناسب با نیاز پژوهش انجام شود.

یکی از مهم‌ترین این تنظیمات، تعیین آستانه‌های Strong Binder (SB) و Weak Binder (WB) است. این آستانه‌ها بر اساس Percentile Rank (%Rank) تعریف می‌شوند؛ یعنی جایگاه نسبی هر پپتید در مقایسه با مجموعه بزرگی از پپتیدهای تصادفی. به‌طور پیش‌فرض، پپتیدهایی با %Rank کمتر از ۰٫۵ به‌عنوان Strong Binder و پپتیدهایی با %Rank کمتر از ۲ به‌عنوان Weak Binder در نظر گرفته می‌شوند.

همچنین می‌توانید یک آستانه برای فیلتر کردن نتایج تعیین کنید تا ابزار تنها پپتیدهایی با %Rank کمتر از مقدار مشخص‌شده را در خروجی نمایش دهد. اگر این مقدار روی -99 باقی بماند، ابزار همه نتایج را بدون فیلتر نمایش می‌دهد.

از دیگر تنظیمات کاربردی این بخش می‌توان به موارد زیر اشاره کرد:

• نمایش هم‌زمان نتایج Binding Affinity در کنار پیش‌بینی Eluted Ligand
• فعال کردن پیش‌بینی Pathogen Epitopes
• فعال کردن پیش‌بینی Neoepitopes
• مرتب‌سازی نتایج بر اساس Eluted Ligand Score
• خروجی گرفتن از نتایج در قالب فایل Excel

اگر برای اولین بار از NetMHCpan استفاده می‌کنید، معمولاً نیازی به تغییر این تنظیمات نیست و مقادیر پیش‌فرض برای اغلب پروژه‌ها مناسب هستند.

مرحله چهارم؛ ارسال درخواست و دریافت نتایج

پس از تکمیل تنظیمات، کافی است روی دکمه Submit کلیک کنید تا تحلیل آغاز شود.

در ابتدا، وضعیت درخواست به‌صورت Queued یا Running نمایش داده می‌شود و پس از پایان پردازش، صفحه نتایج به‌طور خودکار در مرورگر باز خواهد شد. اگر زمان اجرای تحلیل طولانی باشد، می‌توانید آدرس ایمیل خود را نیز وارد کنید تا پس از اتمام پردازش، لینک نتایج برای شما ارسال شود. خروجی هر تحلیل تا ۲۴ ساعت روی سرور NetMHCpan ذخیره می‌شود.

خروجی NetMHCpan 4.2 چگونه تفسیر می‌شود؟

پس از اجرای تحلیل، NetMHCpan 4.2 نتایج پیش‌بینی را به‌صورت جدولی ارائه می‌کند و در هر سطر، یک پپتید از توالی پروتئینی ورودی و ویژگی‌های مرتبط با برهم‌کنش آن با مولکول MHC را گزارش می‌کند. این جدول اطلاعاتی مانند موقعیت و توالی پپتید، هسته اتصال، امتیاز پیش‌بینی Eluted Ligand، مقدار %Rank و طبقه‌بندی پپتید به‌عنوان Strong یا Weak Binder را دربر می‌گیرد.

در مثال عملی این مقاله، نتایج برای توالی QHD43415_5 با طول پپتید ۹ آمینواسید و برای HLA-A01:01 بررسی شده است.

مشخصات کلی تحلیل را از کجا بخوانیم؟

پیش از جدول نتایج، NetMHCpan برخی از تنظیمات مورد استفاده در تحلیل را نمایش می‌دهد. در مثال ما، عبارت Prediction Mode: EL with Context نشان می‌دهد که پیش‌بینی با استفاده از مدل Eluted Ligand و همراه با اطلاعات زمینه‌ای پپتید انجام شده است.

در این تحلیل، طول پپتید نیز 9-mer تعیین شده است. این نکته هنگام تفسیر ستون‌های Core ، Icore ، Of ، Gp ، Gl ، Ip و Il اهمیت دارد؛ زیرا برای پپتیدهای 8 و 9 آمینواسیدی، مدل به deletion نیاز ندارد و ویژگی‌های جدید مربوط به deletion در این حالت عملاً وارد مدل نمی‌شوند.

ستون‌های اصلی جدول خروجی NetMHCpan

در ادامه به بررسی بخش‌های مختلف خروجی ابزار می‌پردازیم:

مشخصات پپتید و الل MHC

جدول خروجی با ستون Pos شروع می‌شود. این ستون موقعیت شروع پپتید در توالی پروتئینی اصلی را نشان می‌دهد؛ بنابراین می‌توان مشخص کرد که هر پپتید دقیقاً از کدام موقعیت پروتئین استخراج شده است.

MHC آللی را نشان می‌دهد که پیش‌بینی برای آن انجام شده است. در مثال ما، این مقدار برای ردیف‌های خروجی HLA-A01:01 است.

Peptide توالی کامل پپتیدی است که NetMHCpan آن را ارزیابی کرده است.

Identity نیز شناسه توالی پروتئینی ورودی را مشخص می‌کند؛ در این مثال، شناسه QHD43415_5 است.

ستون‌های Core و Icore

Core هسته حداقلی 9 آمینواسیدی است که برای هم‌تراز کردن توالی‌ها و شناسایی موقعیت‌های مهم اتصال پپتید به MHC استفاده می‌شود. این هسته همیشه 9 آمینواسید طول دارد.

Icore (Interaction Core) بخشی از پپتید است که تمام باقی‌مانده‌های واقع در محدوده تماس با MHC را دربر می‌گیرد و از دید کاربردی، توالی‌ای است که می‌تواند به‌عنوان کاندیدای اولیه لیگاند یا اپی‌توپ برای اعتبارسنجی بیشتر در نظر گرفته شود. در مثال ما، چون پپتیدها 9-mer هستند، Peptide ، Core و Icore در ردیف‌های نمایش‌داده‌شده یکسان‌اند.

در پپتیدهای 10 تا 14 امینواسیدی، تفاوت این مفاهیم می‌تواند اهمیت بیشتری پیدا کند؛ به‌خصوص به دلیل امکان وجود بخش‌های bulging و deletion در پپتیدهای بلندتر.

پارامترهای مربوط به هم‌ترازی و ساختار پپتید

در خروجی NetMHCpan چند ستون با نام‌های Of ، Gp ، Gl ، Ip و Il نیز وجود دارد که اطلاعات مربوط به نحوه هم‌تراز شدن پپتید با هسته اتصال را نشان می‌دهند.

Of – موقعیت شروع Core در داخل Peptide را نشان می‌دهد و مقدار بزرگ‌تر از صفر نشان‌دهنده پیش‌بینی یک protrusion در انتهای N پپتید است.

Gp موقعیت deletion و Gl طول deletion را نشان می‌دهند.

Ip موقعیت insertion و Il طول insertion را مشخص می‌کنند.

در مثال ما که از پپتیدهای 9-mer استفاده شده است، این مقادیر در ردیف‌های نمایش‌داده‌شده صفر هستند.

اهمیت این پارامترها در پپتیدهای بلندتر بیشتر می‌شود؛ جایی که NetMHCpan باید نحوه قرارگیری پپتید در شیار اتصال MHC و موقعیت باقی‌مانده‌های bulging را تعیین کند. در نسخه 4.2، ترکیب آمینواسیدهای حذف‌شده و فراوانی تماس موقعیتی آن‌ها با MHC نیز به‌عنوان ویژگی‌های جدید وارد مدل شده‌اند و بهبود عملکرد به‌ویژه در پپتیدهای 10 تا 14-mer مشاهده شده است.

Score_EL؛ امتیاز خام پیش‌بینی Eluted Ligand

این امتیاز نشان می‌دهد مدل تا چه اندازه یک پپتید را شبیه لیگاندهایی می‌داند که به‌صورت طبیعی با MHC ارائه شده‌اند.

در خروجی مثال ما، دو پپتید زیر را مقایسه کنید:

GTDLEGNFY → Score_EL = 0.991013

HMELPTGVH → Score_EL = 0.055143

امتیاز بالاتر پپتید GTDLEGNFY نشان می‌دهد که مدل EL آن را بسیار محتمل‌تر از HMELPTGVH به‌عنوان یک لیگاند ارائه‌شده در نظر گرفته است.

با این حال، نباید صرفاً بر اساس Score_EL درباره مناسب‌بودن یک پپتید تصمیم‌گیری کرد.

%Rank_EL؛ مهم‌ترین معیار برای تفسیر نتایج

%Rank_EL رتبه نسبی امتیاز پیش‌بینی‌شده پپتید را در مقایسه با مجموعه‌ای از پپتیدهای طبیعی تصادفی نشان می‌دهد. برخلاف Score_EL، این معیار برای مقایسه نتایج مناسب‌تر است و هرچه مقدار آن کمتر باشد، پیش‌بینی مطلوب‌تر است.

در خروجی مثال ما، این تفاوت به‌خوبی دیده می‌شود. پپتید GTDLEGNFY دارای %Rank_EL = 0.005 است، در حالی که مقدار %Rank_EL برای HMELPTGVH برابر 1.884 است. بنابراین، از نظر رتبه نسبی، GTDLEGNFY در جایگاه بسیار بهتری قرار دارد و پیش‌بینی مدل برای آن قوی‌تر است.

Strong Binder و Weak Binder

ستون BindLevel نتیجه طبقه‌بندی پپتید را بر اساس %Rank نشان می‌دهد.

در مثال حاضر، GTDLEGNFY با %Rank برابر 0.005 در محدوده Strong Binder قرار گرفته، در حالی که HMELPTGVH با %Rank برابر 1.884 به‌عنوان Weak Binder طبقه‌بندی شده است. در این تحلیل، آستانه Strong Binder برابر 0.5 و آستانه Weak Binder برابر 2 تعیین شده است.

کدام پپتیدها را برای ادامه بررسی انتخاب کنیم؟

انتخاب پپتیدهای کاندید از خروجی NetMHCpan 4.2 بهتر است بر اساس %Rank_EL و در کنار آن، وضعیت BindLevel انجام شود. %Rank_EL پایین‌تر نشان‌دهنده رتبه بهتر پپتید در مقایسه با مجموعه پپتیدهای طبیعی است و BindLevel نیز مشخص می‌کند که پپتید در محدوده Strong Binder یا Weak Binder قرار گرفته است.

در مثال این مقاله، از میان 298 پپتید 9-mer بررسی‌شده برای HLA-A01:01، سه پپتید به‌عنوان Strong Binder و 10 پپتید به‌عنوان Weak Binder شناسایی شده‌اند. بنابراین، پپتیدهای Strong Binder در اولویت بالاتری برای بررسی قرار می‌گیرند، اما Weak Binderها نیز بسته به هدف مطالعه می‌توانند به‌عنوان کاندیدهای قابل بررسی در نظر گرفته شوند.

Strong Binder بودن به‌تنهایی به معنای اثبات اپی‌توپ یا ایمنی‌زایی نیست. NetMHCpan یک پیش‌بینی محاسباتی از ارائه پپتید انجام می‌دهد و انتخاب نهایی کاندیداها باید بر اساس هدف پژوهش و در صورت نیاز با شواهد و اعتبارسنجی‌های آزمایشگاهی تکمیل شود. این موضوع با رویکرد مقاله NetMHCpan 4.2 نیز سازگار است؛ چراکه مدل علاوه بر پیش‌بینی ارائه آنتی‌ژن، برای پیش‌بینی اپی‌توپ‌های پاتوژنی و نئوآنتی‌ژن‌ها نیز به‌صورت اختصاصی تنظیم شده است، اما بهبود حاصل از Transfer Learning به نوع دیتا وابسته بوده و انتقال عملکرد میان داده‌های پاتوژنی و نئوآنتی‌ژن‌ها محدود گزارش شده است.

جمع‌بندی

NetMHCpan یکی از ابزارهای مهم در ایمونوانفورماتیک برای پیش‌بینی اتصال و ارائه پپتیدها توسط MHC کلاس I است که در مسیر تکامل خود از پیش‌بینی صرفِ اتصال پپتید، به سمت مدل‌سازی دقیق‌تر Antigen Presentation و شناسایی اپی‌توپ‌های CD8+ حرکت کرده است. نسخه NetMHCpan 4.2 با استفاده از داده‌های جدید Binding Affinity و Eluted Ligand، افزایش پوشش آلل‌های HLA، افزودن ویژگی‌های ساختاری و Transfer Learning این مسیر را ادامه داده است.

در این مقاله، علاوه بر آشنایی با عملکرد و تفاوت نسخه‌های NetMHCpan، نحوه استفاده از NetMHCpan 4.2 را با یک مثال واقعی بررسی کردیم و یاد گرفتیم چگونه خروجی‌هایی مانند Peptide ، Core ، Icore ، Score_EL ، %Rank_EL و BindLevel را تفسیر کنیم.

بااین‌حال، NetMHCpan یک ابزار پیش‌بینی است؛ بنابراین حتی بهترین کاندیداها نیز برای تأیید نهایی به بررسی‌های زیستی و در صورت نیاز، اعتبارسنجی آزمایشگاهی نیاز دارند. در نتیجه، بهترین استفاده از این ابزار زمانی است که نتایج محاسباتی در کنار زمینه زیستی و هدف مشخص پژوهش تفسیر شوند.

آموزش‌های مرتبط 🙂

سوالات متداول درباره NetMHCpan