HISAT2: معرفی، دانلود نرم‌افزار و آموزش اجرای دستورات

معرفی HISAT2 و جایگاه آن در بیوانفورماتیک

HISAT2 (Hierarchical Indexing for Spliced Alignment of Transcripts) یکی از ابزارهای سریع، حساس و کارآمد بیوانفورماتیک برای الاینمنت خوانش‌های توالی‌یابی نسل جدید با ژنوم انسان است. این نرم‌افزار که توسط Daehwan Kim و همکارانش توسعه یافته، برای نگاشت (mapping) دیتای توالی‌یابی whole-genome ، transcriptome و exome طراحی شده و علاوه بر ژنوم رفرنس خطی، می‌تواند تنوع ژنتیکی موجود در جمعیت انسانی را نیز در فرایند همترازی لحاظ کند.

نوآوری اصلی HISAT2 در بهره‌گیری از یک چارچوب گراف‌محور برای ایندکس‌گذاری ژنوم است؛ چارچوبی که با استفاده از Graph FM Index (GFM) و نسخه‌ی سلسله‌مراتبی آن یعنی Hierarchical Graph FM Index (HGFM)، امکان جست‌وجوی سریع را در میان ژنوم رفرنس و تعداد زیادی از واریانت‌های ژنتیکی فراهم می‌کند. این ویژگی باعث می‌شود HISAT2 در مقایسه با روش‌های متکی بر یک رفرنس خطی، به‌ویژه در نواحی بسیار چندشکل و پرتنوع ژنومی، از حساسیت و دقت بالاتری برخوردار باشد.

HISAT2 با ترکیب یک ایندکس سراسری و مجموعه‌ای از ایندکس‌های محلی کوچک، قادر است خوانش‌ها (reads) را به‌صورت مؤثر و دقیق همتراز کند. همچنین خروجی آن در قالب SAM ارائه می‌شود که سازگاری آن را با ابزارهای متداولی مانند SAMtools و GATK تضمین می‌کند. در مجموع، HISAT2 به‌عنوان ابزاری متن‌باز و عملی، یکی از روش‌های مهم و پیشرفته برای همترازی داده‌های توالی‌یابی و تحلیل واریانت‌های ژنتیکی در مقیاس ژنوم به‌شمار می‌رود.

در این مقاله، به بررسی جامع HISAT2 از مبانی الگوریتمی و معماری گراف‌محور آن تا کاربردهای عملی در آنالیز داده‌ها خواهیم پرداخت. همچنین نحوه دانلود، ساخت ایندکس، اجرای دستورات خط فرمان و تفسیر نتایج الاینمنت را آموزش می‌دهیم. این راهنما برای دانشجویان، پژوهشگران و متخصصان بیوانفورماتیک که با داده‌های ژنومیک، ترنسکریپتومیک (RNA-Seq) و تحلیل واریانت‌ها سروکار دارند، منبعی جامع و ارزشمند خواهد بود.

اصول الگوریتمی HISAT2

در این بخش، الگوریتم‌های زیربنایی HISAT2 را شرح می‌دهیم:

این ابزار از یک ساختار داده جدید مبتنی بر گراف (graph-based data structure) و یک الگوریتم الاینمنت استفاده می‌کند تا خوانش‌های توالی‌یابی را به سرعت و با دقت بالا با ژنوم و مجموعه بزرگی از واریانت‌های کوچک تطبیق دهد. همچنین، HISAT2 یک الگوریتم ایندکس‌گذاری نوین برای توالی‌های تکراری در ژنوم معرفی کرده است. این الگوریتم به گونه‌ای عمل می‌کند که الاینمنت یک خوانش تکراری ابتدا به یک مکان واحد نگاشت می‌شوند و سپس به طور کامل بازیابی می‌گردند.

نمایش جمعیت‌های انسانی در قالب گراف

ژنوم رفرنس انسان (مثل GRCh38) تنها بر اساس اطلاعات ژنتیکی چند نفر ساخته شده است و تنوع ژنتیکی کل جمعیت را شامل نمی‌شود. این موضوع باعث می‌شود ابزارهای اجرای الاینمنت در مواجهه با ژنوم‌های جدید و متفاوت دچار خطا شوند.

الگوریتم HISAT2 به‌جای استفاده از یک رشته خطی ساده، از ساختار گراف (Graph) استفاده می‌کند. در این گراف، تمام جهش‌ها، حذف‌ها و اضافه‌شدن‌های ژنتیکی (Variants) به‌عنوان مسیرهای جایگزین و فرعی تعریف می‌شوند.

برای اینکه جستجو در این گرافِ پیچیده سریع و بهینه باشد، دو کار مهم انجام می‌شود:

• فشرده‌سازی هوشمند داده‌ها: گراف به شکلی خاص (Prefix-sorted) مرتب می‌شود و با استفاده از یک ترفند ریاضی (نگاشت Last-First)، ارتباطات بین نقاط گراف به شکلی فشرده ذخیره می‌شود که نیاز به رَم را به‌شدت کاهش می‌دهد.
• استفاده از ایندکس‌های محلی (HGFM): سیستم علاوه بر یک نقشه کلی، هزاران نقشه کوچک (در حد ۵۷ کیلوباز) می‌سازد. این نقشه‌های کوچک آن‌قدر سبک هستند که مستقیماً در حافظه پنهان و فوق‌سریع پردازنده (CPU Cache) قرار می‌گیرند و سرعت جستجو را چند برابر می‌کنند.

با این معماری، HISAT2 موفق شده کل ژنوم انسان به‌علاوه ۱۴.۵ میلیون تنوع ژنتیکی شناخته‌شده را تنها در ۶.۲ گیگابایت حافظه جا دهد. این روش نسبت به ابزارهای قبلی دقت بسیار بالاتری دارد و با وجود پردازش اطلاعاتِ به‌مراتب بیشتر، افت سرعت چندانی ندارد.

در تصویر بالا، تبدیل یک توالی ژنتیکی ساده به یک ساختار داده فشرده و هوشمند را مشاهده می‌کنید که مراحل آن عبارتند از:

مرحله اول: توالی رفرنس

این ساده‌ترین حالت ممکن است. یک توالی ۶ حرفی (G-A-G-C-T-G) را می‌بینید که به‌صورت یک خط مستقیم و بدون هیچ‌گونه تنوع یا جهش ژنتیکی رسم شده است.

مرحله دوم: گراف اصلی

حالا برای اینکه تفاوت‌های ژنتیکی بین انسان‌های مختلف پوشش داده شود، ۳ نوع تغییر ژنتیکی (Variant) به عنوان مسیرهای جایگزین و فرعی به توالی اضافه شده‌اند:

• جهش نقطه‌ای (SNV): در مسیر پایین دایره دوم، می‌بینیم که حرف A می‌تواند به T تغییر کند.
• حذف (Deletion): فلشی از بالای C مستقیماً به G کشیده شده است. اگر توالی از این مسیر برود، یعنی حرف T حذف شده است.
• درج (Insertion): فلشی در پایین اضافه شده که نشان می‌دهد یک حرف A می‌تواند بین T و G اضافه شود.

مرحله سوم: گراف مرتب‌شده (Prefix-sorted graph)

گراف مرحله قبل برای کامپیوتر کمی گیج‌کننده است. برای جستجوی سریع‌تر، ساختار گراف بر اساس ترتیب الفبایی مرتب می‌شود. به هر دایره (گره) یک شماره جدید (اعداد آبی رنگ زیر دوایر) داده می‌شود. این رتبه‌بندی کمک می‌کند تا جستجو با نظم مشخصی انجام شود. حرف Z هم در انتها اضافه شده تا به سیستم بگوید توالی دقیقاً در اینجا به پایان می‌رسد.

مرحله چهارم: نمایش جدولی

در این مرحله، کل گراف بدون از دست رفتن اطلاعات به یک جدول فشرده تبدیل می‌شود تا حافظه بسیار کمی اشغال کند:

• ستون خروجی‌ها: حرفِ هر گره دقیقاً به تعداد مسیرهای خروجی‌اش تکرار می‌شود (مثلاً گره C چون ۳ خروجی دارد، ۳ بار نوشته شده است).
• ستون ورودی‌ها: فقط نشان می‌دهد که گره قبلی (حرف مبدأ) چه بوده است.
• ارتباط Last-First (فلش آبی): ترفند اصلی جدول! این قانون ریاضی نیاز به ذخیره خطوط ارتباطی را حذف می‌کند: مثلاً «دومین حرف G» در ستون آخر (ورودی‌ها)، مستقیماً با «دومین حرف G» در ستون اول (خروجی‌ها) در ارتباط است

مدیریت توالی‌های تکراری

در ژنوم انسان توالی‌های تکراری زیادی وجود دارد. وقتی قطعات خوانش‌شده به این بخش‌ها می‌رسند، ممکن است با ده‌ها یا صدها نقطه مختلف در ژنوم تطابق داشته باشند (حدود ۱ تا ۳ درصد از داده‌ها این حالت را دارند). ابزارهای معمولی (مثل BWA) یا فقط یکی از این نقاط را به‌صورت تصادفی گزارش می‌دهند، یا اگر بخواهند همه را گزارش دهند، حجم فایل خروجی به شکل غیرقابل‌کنترلی بالا می‌رود.

HISAT2 تمام توالی‌های دقیقاً مشابه که در جاهای مختلف ژنوم پراکنده شده‌اند را با هم ترکیب می‌کند و آن‌ها را به‌عنوان یک توالی نماینده در نظر می‌گیرد. حالا اگر یک Read متعلق به این بخش‌های تکراری باشد، به‌جای اینکه مثلاً به ۱۰۰ مکان مختلف الاین شود، فقط یک‌بار به این توالی نماینده متصل می‌شود.

این ترفند باعث می‌شود فایل‌های خروجی به‌شدت سبک شوند.

نرم‌افزار HISAT2 کتابخانه‌ها و رابط‌های برنامه‌نویسی اختصاصی برای زبان‌های پایتون، جاوا و C++ ارائه می‌دهد تا در مراحل بعدی آنالیز ژنومیک (مثل شناسایی واریانت‌ها یا Variant Calling)، سیستم بتواند در صورت نیاز، مکان‌های واقعی این قطعات را روی ژنوم اصلی با سرعت بالا بازیابی کند.

دانلود HISAT2

نسخه‌های باینری را می‌توانید از لینک‌های زیر دانلود کنید. نسخه‌های باینری برای معماری‌های اینتل (x86_64) در سیستم‌عامل‌های لینوکس و مک (Mac OS X) ارائه شده‌اند.

رمز فایل فشرده: www.vanyarbioinf.ir

ابزار HISAT2 در سیستم‌عامل‌های لینوکس، مک OS و ویندوز (از طریق WSL) قابل اجراست.

توجه: یک سیستم با حداقل 8 گیگابایت RAM برای ژنوم‌های کوچک تا متوسط و 16 گیگابایت یا بیشتر برای ژنوم‌های بزرگ مانند انسان توصیه می‌شود. همچنین، داشتن چندین هسته پردازشی می‌تواند سرعت آنالیز را به طور قابل توجهی افزایش دهد.

پیش‌نیازهای اجرای الاینمنت با HISAT2

فرایند پیش از الاینمنت شامل دو گام اساسی است: دسترسی به ژنوم رفرنس و پیکربندی ایندکس‌های اختصاصی. در ادامه، نقشه‌ی راهِ اجرایی این دو مرحله را بررسی می‌کنیم.

دانلود ژنوم رفرنس

اولین قدم در استفاده از HISAT2، تهیه ژنوم رفرنس مناسب است. می‌توانید ژنوم مرجع را از دیتابیس‌های معتبر مانند ENSEMBL ، UCSC یا NCBI دانلود کنید.

ساخت ایندکس HISAT2

دومین قدم قبل از اجرای الاینمنت، ساخت ایندکس است. این مرحله به HISAT2 اجازه می‌دهد تا جستجوی سریع و کارامدی را در ژنوم رفرنس انجام دهد. ساخت ایندکس فقط یک بار برای هر ژنوم رفرنس انجام می‌شود.

HISAT2 بر اساس اندازه ژنوم رفرنس، تصمیم می‌گیرد از چه نوع ایندکسی استفاده کند:

• ایندکس کوچک: برای ژنوم‌های کمتر از ۴ میلیارد نوکلئوتید. ایندکس‌ها با پسوند .ht2 ذخیره می‌شوند و از اعداد ۳۲ بیتی استفاده می‌کنند.
• ایندکس بزرگ: برای ژنوم‌های طولانی‌تر. ایندکس‌ها با پسوند .ht2l ذخیره می‌شوند و از اعداد ۶۴ بیتی استفاده می‌کنند.

*** کاربر نیازی به دخالت ندارد؛ اسکریپت‌های HISAT2 به طور خودکار نوع ایندکس مناسب را تشخیص می‌دهند و آن را می‌سازند.

🔴 الگوریتم ساخت ایندکس

• این ابزار بر پایه FM Index (ابداع Ferragina و Manzini) و Burrows-Wheeler Transform طراحی شده است.
• برای ساخت ایندکس از الگوریتم blockwise کارکاینن (Karkkainen) استفاده می‌شود که به کاربر اجازه می‌دهد بین زمان اجرا و میزان مصرف حافظه (RAM) تعادل ایجاد کند.
• به صورت پیش‌فرض، برنامه خودش بهترین تنظیمات را برای سرعت بالا بدون تمام شدن حافظه (RAM) پیدا می‌کند (قابلیت خودکار).

🟣 نیازمندی‌های سخت‌افزاری

• ساخت ایندکس معمولی: روی یک کامپیوتر معمولی با ۸ گیگابایت رم (RAM) قابل انجام است.
• ساخت ایندکس با استفاده از SNP، محل‌های پیرایش (SS) و اگزون‌ها: به دلیل ساختار گراف (Graph construction)، برای ژنوم انسان به حدود ۲۰۰ گیگابایت رم نیاز دارد.

🟠 ساخت ایندکس با دستور خط فرمان

ساختار کلی دستور به این صورت است:

hisat2-build [options]* <reference_in> <ht2_base>

• <reference_in>: لیست فایل‌های FASTA (جدا شده با کاما) یا خودِ توالی‌ها (اگر از گزینه -c استفاده شود).
• <ht2_base>: نام پایه (Basename) که می‌خواهید فایل‌های خروجی با آن نام‌گذاری شوند.

توجه: برای کاهش مصرف حافظه و ساده‌تر شدن فرایند کار، امکان دانلود ایندکس‌های آماده به‌صورت رایگان نیز وجود دارد؛ بنابراین لازم نیست حتماً ایندکس را خودتان بسازید 🙂

همترازی خوانش‌ها با استفاده از HISAT2

اکنون می‌توانیم به محیط خط فرمان وارد شویم … در بخش پیش رو، می‌آموزیم که چگونه با تعیین فایل‌های ورودی و به‌کارگیری گزینه‌های کنترلی، فرایند الاینمنت را متناسب با نیاز خود تنظیم کنیم.

قالب کلی دستور عبارتست از:

hisat2 [options]* -x <hisat2-idx> {-1 <m1> -2 <m2> | -U <r> | --sra-acc <SRA accession number>} [-S <hit>]

یعنی HISAT2 برای اجرا به این‌ موارد نیاز دارد (آرگومان‌های اصلی):

1. ایندکس رفرنس (-x)
2. یکی از این نوع داده‌های ورودی:
   • خوانش‌های paired-end با -1 و -2
   • خوانش‌های single-end با -U
   • یا داده‌های SRA با --sra-acc (این گزینه برای زمانی است که می‌خواهید داده‌ها را مستقیم از SRA بگیرید)
3. و در صورت نیاز، فایل خروجی SAM با -S (اگر این آپشن را تعیین نکنید، خروجی به صورت پیش‌فرض به stdout می‌رود؛ یعنی در ترمینال چاپ می‌شود)

از آپشن‌های این دستور می‌توان به سه مورد زیر در رابطه با تعیین فرمت فایل ورودی اشاره کرد:

• -q (پیش‌فرض): یعنی فایل‌های شما FASTQ هستند (معمولاً دارای کیفیت توالی یا Quality Score).
• -f: یعنی فایل‌های شما FASTA هستند. چون FASTA اطلاعات کیفیت ندارد، HISAT2 خودش به صورت خودکار --ignore-quals را فعال می‌کند.
• -c: بسیار جالب است؛ اگر می‌خواهید توالی‌ها را مستقیماً در ترمینال تایپ کنید (مثلاً برای تست سریع)، از این گزینه استفاده می‌کنید.

مثال کاربردی :

فرض کنید می‌خواهید یک فایل FASTQ را تراز کنید، ۵ بازِ اول آن را حذف کنید و فقط ۵۰۰۰ خوانش اول را پردازش کنید:

hisat2 -x genome_index -q -1 reads_1.fq -2 reads_2.fq -5 5 -u 5000 -S output.sam

--trim5 یا -5 یک گزینه در HISAT2 است که به شما اجازه می‌دهد تعداد مشخصی از بازها (bases) را از انتهای چپ (سمت ۵’) هر خوانش حذف کنید، قبل از اینکه HISAT2 شروع به تراز کردن کند.

گزینه -u (یا --upto) در HISAT2 به شما اجازه می‌دهد تعداد محدودی از خوانش‌ها را پردازش کنید و سپس متوقف شوید.

خلاصهٔ نتایج الاینمنت با HISAT2

در پایان هم‌ترازسازی، خلاصه‌ای از نتایج برای شما چاپ می‌شود. تفسیر آن به این صورت است:

مثال اول: داده‌های Single-End

20000 reads; of these:
  20000 (100.00%) were unpaired; of these:
    1247 (6.24%) aligned 0 times
    18739 (93.69%) aligned exactly 1 time
    14 (0.07%) aligned >1 times
93.77% overall alignment rate

🟥 تفسیر خروجی:

• 20000 reads وارد HISAT2 شده‌اند.
• همه آن‌ها unpaired (تک‌خوانش) هستند.

نتایج نشان می‌دهد: که 6.24% اصلاً مپ نشده‌اند | 93.69% دقیقاً یک بار مپ شده‌اند | 0.07% به بیش از یک محل مپ شده‌اند.

بنابراین:

93.77% overall alignment rate

یعنی حدود 93.8٪ از خوانش‌ها حداقل یک بار روی ژنوم رفرنس مپ شده‌اند.

مثال دوم: داده‌های Paired-End

10000 reads; of these:
  10000 (100.00%) were paired; of these:
    650 (6.50%) aligned concordantly 0 times
    8823 (88.23%) aligned concordantly exactly 1 time
    527 (5.27%) aligned concordantly >1 times

در داده‌های paired-end، دو mate باید فاصله مناسبی از هم داشته باشند و جهت (orientation) مورد انتظار را داشته باشند. اگر هر دو شرط برقرار باشد، جفت خوانش concordant محسوب می‌شود.

🟥 تفسیر خروجی:

از 10000 جفت خوانش، 650 تا concordant map نشده | 8823 تا concordant و یکتا map شده | 527 تا concordant و چندمحلی map شده.

650 pairs aligned concordantly 0 times; of these:
  34 (5.23%) aligned discordantly 1 time

از 650 جفتی که concordant مپ نشده‌اند، 34 جفت به صورت discordant مپ شده‌اند. یعنی هر دو mate مپ شده‌اند ولی فاصله یا جهت آن‌ها با انتظار HISAT2 سازگار نیست.

616 pairs aligned 0 times concordantly or discordantly

زیرا:

650 - 34 = 616

این 616 جفت نه concordant و نه discordant مپ نشده‌اند.

1232 mates make up the pairs

هر جفت دو mate دارد:

616 × 2 = 1232

سپس HISAT2 هر mate را جداگانه بررسی می‌کند:

660 (53.57%) aligned 0 times
571 (46.35%) aligned exactly 1 time
1 (0.08%) aligned >1 times

نرخ الاینمنت کلی:

96.70% overall alignment rate

این مقدار درصد خوانش‌هایی است که در نهایت حداقل یک alignment معتبر پیدا کرده‌اند (چه به صورت concordant، چه discordant، چه به صورت mate منفرد). بنابراین این عدد صرفاً برابر با درصد concordant alignment نیست.

آشنایی با HISAT-3N

HISAT-3N نسخه‌ای توسعه‌یافته از HISAT2 است که برای همترازسازی داده‌های حاصل از فناوری‌های Nucleotide Conversion Sequencing (NC-Seq) طراحی شده است. در این فناوری‌ها، طی آماده‌سازی نمونه یا فرایندهای بیولوژیکی خاص، برخی نوکلئوتیدها به نوکلئوتیدهای دیگری تبدیل می‌شوند؛ برای مثال تبدیل سیتوزین به تیمین در Bisulfite Sequencing (BS-seq) یا تبدیل تیمین به سیتوزین در SLAM-seq. این تغییرات باعث می‌شوند ابزارهای همترازسازی معمولی مانند HISAT2 ، STAR یا BWA این بازهای تبدیل‌شده را به‌عنوان mismatch تفسیر کنند و در نتیجه دقت همترازسازی کاهش یابد. HISAT-3N با استفاده از یک راهبرد «سه‌نوکلئوتیدی» (3-Nucleotide Alignment) این مشکل را برطرف کرده و امکان همترازسازی دقیق خوانش‌های حاصل از انواع فناوری‌های مبتنی بر تبدیل نوکلئوتید را فراهم می‌کند.

برخلاف ابزارهایی مانند Bismark یا SLAM-DUNK که هر کدام برای یک فناوری خاص توسعه یافته‌اند، HISAT-3N یک چارچوب عمومی ارائه می‌دهد که می‌تواند انواع داده‌های NC-Seq شامل BS-seq ، TAPS ، SLAM-seq و سایر روش‌های مشابه را برای داده‌های DNA و RNA پردازش کند. این ابزار با بهره‌گیری از زیرساخت ایندکس‌گذاری سلسله‌مراتبی و الگوریتم‌های بهینه HISAT2، سرعت بالا، دقت بیشتر، مقیاس‌پذیری مناسب و مصرف حافظه کمتری نسبت به بسیاری از ابزارهای موجود ارائه می‌دهد. به همین دلیل HISAT-3N به‌عنوان یکی از پیشرفته‌ترین گزینه‌ها برای همترازسازی داده‌های مبتنی بر تبدیل نوکلئوتید شناخته می‌شود و می‌تواند نقش مهمی در مطالعات اپی‌ژنتیک، RNA Editing، متیلاسیون DNA و بررسی فرایندهای سلولی پویا ایفا کند.

مقایسه HISAT2 با ابزارهای مشابه

از بین ابزارهای امروزی، STAR مهم‌ترین رقیب HISAT2 است و Subread نیز گزینه‌ای معتبر محسوب می‌شود. TopHat2 بیشتر ارزش تاریخی دارد و امروزه دیگر توصیه نمی‌شود.

HISAT2 و STAR دو الاینر پرکاربرد RNA-Seq هستند که دقت مشابهی در تشخیص محل‌های پیرایش (splice junctions) دارند. STAR معمولاً سریع‌تر است و قابلیت‌های پیشرفته‌تری برای شناسایی fusion transcriptها و splice junctionهای جدید ارائه می‌دهد، اما به حافظه بسیار بیشتری نیاز دارد. در مقابل، HISAT2 با مصرف حافظه حدود 4 تا 5 گیگابایت، دقتی مشابه STAR را حفظ می‌کند و به همین دلیل یکی از متعادل‌ترین گزینه‌ها برای تحلیل داده‌های RNA-Seq محسوب می‌شود.

جمع‌بندی

HISAT2 یکی از مهم‌ترین همترازکننده‌های (Aligner) نسل جدید است که با ترکیب سرعت بالا، دقت مناسب و مصرف حافظه پایین، جایگاه ویژه‌ای در تحلیل دیتای ژنومی و ترنسکریپتومی به دست آورده است. معماری مبتنی بر گراف و استفاده از ایندکس‌های سلسله‌مراتبی به این ابزار امکان می‌دهد تا علاوه بر ژنوم رفرنس، تنوع ژنتیکی موجود در جمعیت‌ها را نیز در فرایند الاینمنت در نظر بگیرد. این ویژگی در کنار پشتیبانی از همترازسازی splice-aware، ابزار HISAT2 را به یکی از گزینه‌های اصلی برای تحلیل RNA-Seq، بررسی رویدادهای پیرایشی و تولید داده‌های مناسب برای تحلیل‌های پایین‌دستی تبدیل کرده است.

انتخاب صحیح پارامترهای همترازسازی، استفاده از ژنوم رفرنس مناسب و ارزیابی دقیق کیفیت نتایج، تأثیر مستقیمی بر اعتبار تحلیل‌های بعدی خواهد داشت. از این رو، آشنایی با قابلیت‌های HISAT2 می‌تواند به پژوهشگران کمک کند تا از این ابزار به‌صورت مؤثر در پروژه‌های مختلف بیوانفورماتیک و ژنومیک بهره ببرند.

سوالات متداول درباره HISAT2